耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐药机制研究进展

姚丹玲，朱卫民

(重庆医科大学附属第一医院感染科，重庆 400016)

鲍曼不动杆菌最常见于医院环境，因极强的环境适应能力及高水平获得耐药的性质，易引起院内感染暴发流行。同时碳青霉烯类抗生素的广泛不合理使用，耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(Carbapenem resistantAcinetobacter baumannii,CRAB)检出率逐年增加，其产生耐药与碳青霉烯酶，外膜孔蛋白，外排泵，青霉素结合蛋白位点等因素密切相关。

1 碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的流行现状及耐药趋势

自2005年开始，国家性细菌耐药监测网逐步建立起来。2004—2005年我国CHINET监测(中国细菌耐药性监测)对于鲍曼不动杆菌耐药性分析提示此菌对亚胺培南的耐药率为34.9%，对美罗培南的耐药率为43.2%[1]，2017CHINET细菌耐药性监测资料则显示，这两种药物耐药率已分别上升到66.7%和69.3%[2]，对多黏菌素B和替加环素的耐药率较低。2011年以来通过抗菌药物临床应用专项整治活动，全国范围内抗菌药物总的消耗量增幅持续减少，抗菌药物总体使用强度降低，但碳青霉烯类药物的消耗量和使用强度等指标持续上升，直到目前我国各大医院对此类药物仍然存在过度依赖的现象。2011年作为分水岭，通过2011年我国CHINET不动杆菌属细菌耐药性监测显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为65.2%和66.2%[3]，其2005年—2011年耐药率增长速度与2011年—2017年耐药率增长速度相比有明显的倍数关系。同时在2005—2017年的连续监测中发现不动杆菌属(86.0%～93.4%为鲍曼不动杆菌)始终占居菌种总数的前七位，且存在逐年增加趋势，其中河南、陕西、黑龙江、辽宁、湖北、湖南、云南耐药率均较高，耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的耐药率及增长率均居于首位[4]。因为治疗棘手、院内爆发、资源浪费等问题的存在，全球各个国家积极致力于控制耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的流行，并共同努力防止其蔓延至全球。

2 碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌耐药机制

2.1 碳青霉烯酶

碳青霉烯酶的产生是耐药的主要机制之一，其中最重要的是与属于Ambler D类的碳青霉烯酶有关。

2.1.1 A类碳青霉烯酶

A类酶通过丝氨酸残基灭活β-内酰胺键，水解碳青霉烯类抗生素，包括KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)、GES(Guiana extendedspectrum)、SME(Serratiamarcescens enzyme)、IMI(imipenem-resistant)等几种酶。KPC酶首次在肠杆菌科的肺炎克雷伯菌中被发现，具有KPC-2酶活性的肺炎克雷伯菌首次于2007年在浙江被报道[5]。目前已经发现有23种KPC酶基因，KPC酶的编码基因位于质粒上[6]，Martinez等[7]的研究指出肠杆菌科和铜绿假单胞菌分离株检出的KPC酶通常与位于质粒中的转座子Tn 4401相关。这种水平性转移的能力使KPC酶不再局限于肠杆菌科某些细菌中，鲍曼不动杆菌中的发现也越来越多。GES酶同样也是首次在肺炎克雷伯菌中被发现，其中GES-2、GES-14酶基因可水解碳青霉烯类抗生素，多项研究己从鲍曼不动杆菌中分离得到了包括GES-11、GES-14、KPC-2、KPC-3、KPC-4、KPC-10等众多酶基因。这表明GES酶和KPC酶已从肠杆菌科细菌向非发酵菌扩散。

2.1.2 B类碳青霉烯酶

B类碳青霉烯酶又名金属β-内酰胺酶(metalloβ-lactamases,MBLs)，能水解除单环内酰胺类以外的大多数β-内酰胺酶类抗生素，B类酶包括IMP(imipenmase)、VIM(Verona intergon-encoded metallo-β-lactamase)、SIM(Seoulimipenemase)、NDM(New Delhi metallo-β-lactamase)等。

IMP酶已在世界范围内被广泛报道，其基因型多达42种[8]，此类酶对头孢菌素类与碳青霉烯类抗生素也有较强耐药作用。其中大多数IMP酶介导的碳青霉烯类抗生素耐药性报道来自亚洲的铜绿假单胞菌[9]相比于IMP酶，VIM型酶更为常见。1996年，VIM-2酶基因于铜绿假单胞菌中被发现[10]，此类基因最为常见，也是鲍曼不动杆菌中最先发现的VIM酶。目前为止，已经发现了37种VIM酶基因。VIM酶与IMP酶氨基酸序列同源性＜40%，且拥有相似的与底物结合的结构，但VIM酶对于碳青霉烯类抗生素的亲和力更胜IMP酶。

NDM酶的发现较前两种酶晚，NDM-1酶基因于2008年首次发现。NDM-1酶基因与VIM-1酶基因和VIM-2酶基因具有最高的同源性。它是一种28kDa的单体蛋白，表现出与青霉素类和头孢菌素类的紧密结合的特性[11]。一项泰国的研究表明，所有的blaNDM-1基因阳性的鲍曼不动杆菌在其上游具有ISAba125插入序列[12]。

2.1.3 D类碳青霉烯酶

D类碳青霉烯酶，又名OXA类酶，但此类酶无法快速且完全的水解碳青霉烯类抗生素，对头孢菌素类无水解能力，需合并其他耐药机制才能对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药。Kim等[13]的研究指出，OXA类酶引起耐药与其上游存在一个插入序列(insertion sequence,IS)密切相关，IS通过提供启动子，高度表达碳青霉烯酶，使之耐药水平升高。ISAba1序列最为常见，可以插入到blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51等基因上游，提高耐药基因的表达能力，导致对碳青霉烯类抗生素耐药，或增强耐药程度，表现多重耐药。临床多项研究数据显示blaOXA-23、blaOXA-51在大部分地区检出率高，是重要的碳青霉烯酶基因型，同时blaOXA-24、blaOXA-58、blaOXA-143等基因型也存在一定检出率。

世界范围内，blaOXA-23基因在产生耐药的过程中起到至关重要的作用。blaOXA-23基因位于质粒或染色体上，以质粒为主，并且blaOXA-23的水平传播较为频繁[14]。转座子在一个细菌内或不同分离株之间的基因组位置传播中发挥了重要作用[15]。至今为止已在鲍曼不动杆菌中发现与blaOXA-23相关的四种主要转座子，分别为 Tn2006，Tn2007，Tn2008，Tn2009[16-17]。而我国blaOXA-23的水平转移主要与转座子Tn2009 和质粒PAZJ221 有关。研究指出除Tn2007转座子以外的其他所有的转座子，在blaOXA-23基因的上游均可见ISAba1插入序列[17]。

blaOXA-51基因是1996年在阿根廷的一株鲍曼不动杆菌染色体上发现的，被认为是鲍曼不动杆菌的天然基因，对碳青霉烯类抗生素的水解能力较弱[18]。虽然blaOXA-51基因是在染色体上被发现的，但有研究表明，定位于质粒的耐药水平比定位在染色体的耐药水平要高。原因可能是blaOXA-51基因上游 ISAba1提供强启动子，从而基因拷贝增多，耐药水平升高[19]。有其他研究表明新的插入序列ISAba9与blaOXA-51基因过度表达相关，若blaOXA-51上游存在 ISAba9/ISAba1嵌合体元件，可使blaOXA-51基因表达水平较ISAba1单独存在时升高8倍以上[20]。

2.2 外膜孔蛋白

外膜孔蛋白(outermembrane proteins,OMPs)，存在于革兰阴性菌的细胞膜表面或镶嵌其中，是外膜脂质双层结构上的一种特殊的通道蛋白，具有高度选择性、允许亲水小分子物质通过。CarO蛋白(carbapenem-resistantassociated out membrane protein,CarO)、热修饰蛋白(heat-modifiable protern,HMPAB)、外膜蛋白W(out membrane protein W,OmpW)、外膜蛋白A(out membrane proteinA,OmpA)等均是较常见的类型[21]。外膜孔蛋白的缺失或表达下调也是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的重要机制之一，通过阻碍抗生素进入细菌体内而形成耐药。

CarO蛋白是碳青霉稀类抗生素耐药相关外膜蛋白，2002年Limansky等[22]在重症监护室中分离出一株鲍曼不动杆菌Ab242，该菌株对亚胺培南耐药，但碳青霉烯酶阴性，通过对外膜蛋白进行检测，发现该菌株在29kDa处有外膜蛋白的缺失，并将该外膜蛋白命名为CarO蛋白。并且后续通过更深一步的研究明确证实了CarO蛋白与耐药相关。缺乏CarO蛋白原因多与插入元件对基因的破坏相关，常见的插入元件包括ISAba1，ISAba10，ISAba125和ISAba825等，从而改变外膜蛋白，减少抗菌药物进入菌体内而导致耐药。

热修饰蛋白(HMP-AB)与铜绿假单胞菌的外膜蛋白OprF和大肠埃希菌的外膜蛋白OmpA有较高的同源性，允许抗菌药物的通过[23]，参与高水平耐药。同时，Sato等[24]的研究也指出鲍曼不动杆菌临床分离株的数量与OmpA mRNA水平呈显著正相关。

2.3 外排泵

外排泵由转运蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白三个部分组成，与渗透屏障相互协同作用下泵出抗菌药物，共同决定了细菌在细胞内外的渗透数量。外膜孔蛋白和外排泵根据不同的特性选择化合物，并共同保护细菌免受结构多样化的抗生素的影响[25]。在鲍曼不动杆菌中的外排泵包括：耐药节结化细胞分化(resistance nodulation division,RND)超家族、主要易化子(major facilitator superfamily,MFS)超家族、多重药物与有毒复合物外排(multidrug andtoxic compound extrusion,MATE )超家族等[26]。其中，RND超家族是不动杆菌属细菌最主要也是最早发现的外排泵系统，在病原菌毒力因子的调节、排除细胞内代谢产物、调节细胞动态平衡和细胞间信号转导等方面均有一定的作用。

2.4 青霉素结合蛋白位点

青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)是β-内酰胺类抗生素的主要作用靶位，对于细胞壁生物的合成极其重要。研究指出在pH6.3～7.0之间，PBPs表达量的减少也考虑是鲍曼不动杆菌耐药的重要原因之一[27]。Russo研究指出青霉素结合蛋白7/8(PBP-7/8)有助于鲍曼不动杆菌在体内体外存活[28]。

2.5 整合子

整合子捕获外来耐药基因，在启动子作用下得以表达，形成耐药。在目前研究已知的IV型整合子中，I型最为常见，此类整盒子与多种耐药基因密切相关，并且共含有6种基因盒[29]。但整合子I类携带的基因盒与对抗生素产生耐药似乎没有特殊关联，更大程度是通过其他机制的协助作用，此结论也与Japoni等[30]的研究相符，故需要更多的研究来找到I类整合子与耐药之间存在的联系。

3 治疗进展

目前，治疗CRAB的药物有限，常规包括耐碳青霉烯类抗生素、替加环素、黏菌素、舒巴坦复方制剂等，通过药物的单药或联合选择组成不同治疗方案以达到治疗目的：加大碳青霉烯类抗生素剂量、单用替加环素或替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦较为常见。并且有研究表明替加环素联合方案较单药治疗对体内外的CRAB有更好的抗菌活性，能够提高CRAB医院获得性肺炎的治疗疗效。但无论单用或联合，均不能彻底清除细胞内的鲍曼不动杆菌[31]。针对于CRAB医院获得性肺炎，Liang最新研究表明基于替加环素的治疗与非替加环素治疗相比ICU死亡率更高。与替加环素单药治疗相比，黏菌素单药治疗可一定程度上降低ICU死亡率。故此研究提示新的治疗思路：黏菌素单药治疗可能是CRAB医院获得性肺炎更好的抗生素策略[32]。

近日，有研究提出替加环素、环丙沙星、阿米卡星三联制剂方案治疗CRAB，此方案可降低单种抗菌药物的剂量，有利于延迟替加环素耐药菌的产生，降低药物不良反应，在一定程度上清除CRAB效果更好[33]，但这仅是体外实验的结果，需要大量临床应用效果来证实这一结果，提高此结论的严谨性。

为达到早发现、早诊断、早治疗，检测技术也需与时俱进：基质辅助激光解吸电离质谱分析技术作为一种快速易于操作的技术，可以直接从细菌菌落中快速鉴定碳青霉烯酶活性，从而辅助早期规范治疗用药[34]。

针对于耐药现状新型药物研制也在积极进行，BAL30072作为新型铁载体单层表面活性剂，对多种碳青霉烯类抗生素耐药细菌显示出抗菌活性，特别是针对CRAB。Landman研究表明BAL30072同美罗培南或黏菌素合用使抗菌活性增加[35]，但仍需进一步研究明确此药物的潜在临床效用。

西他沙星是一种广谱口服氟喹诺酮类药物，对于92%的CRAB具有抗菌活性，尤其是针对替加环素耐药CRAB血液分离株[36]，由于黏菌素存在肾毒性，西他沙星被认为是CRAB血流感染首选替代药物。目前仍需要更多研究明确其临床疗效。

Eravacycline作为新型合成氟代环素，对CRAB的抗菌活性约为替加环素的2～4倍[37]。头孢他啶/阿维巴坦、FADDI-287、Cefiderocol等多类药物仍处于临床前阶段或临床开发的早期阶段，但新型药物的研究极具潜力，将在未来作为治疗CRAB的关键突破口。

4 结语

耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌在医院的大量检出，导致基础疾病治疗难度增加，住院时间明显延长，尤其是ICU病房检出率极高，致降低死亡率这一目标难以实现。这成为全球关注的医学问题，严重威胁感染性疾病的治疗。鲍曼不动杆菌通过产生碳青霉烯酶、改变外膜孔蛋白、增强外排泵活性、改变青霉素结合蛋白位点及整合子机制等因素的协同作用下，产生交叉耐药或多重耐药。针对严峻的耐药形势，首先，加强医院感染管控，重视预防隔离及手卫生以减少院内传播；其次，通过对其耐药机制的进一步研究，发现已知或未知机制中的新切入点，如三联方案达到延缓耐药等治疗新思路控制和减少耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的产生，甚至有望达到恢复其对耐碳青霉烯类抗生素敏感性这一目标；再者，在药物局限的形势下研发新型药物，BAL30072、西他沙星、Eravacycline、头孢他啶/阿维巴坦、FADDI-287、Cefiderocol等，为治疗用药提供更多选择；最后，新检测技术的实施辅助CRAB的 早期检出。通过新思路、新药物、新技术的协同作用，为临床抗感染治疗及新药研制提供帮助，为耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的治疗带来新希望。