基于HS-SPME-GC/MS指纹图谱及化学计量学的野坝子蜂蜜鉴别

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(1.云南民族大学化学与环境学院,云南昆明 650500; 2.云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南昆明 650106; 3.云南民族大学民族医药学院,云南昆明 650500)

野坝子,又名扫把茶,广泛应用于白族药、彝族药等民族药,其味辛,性凉,具有疏风解表、消食化积、清热利湿等功效[1-6]。野坝子可用于治疗风寒感冒、腹胀积食、消化不良、肠胃炎腹泻、溃烂止血等。同时野坝子也是我国西南山区秋冬期的主要蜜源植物[7-10]。野坝子蜂蜜呈浅绿色、清香浓郁、极易结晶、结晶后为乳白色、质地坚硬,又称 “云南硬蜜”,为上等特色蜜,同时具有保健功能,受到市场的广泛青睐[7-9]。近年来,由于野坝子蜂蜜蜜源较少、蜜价飙升,使得市场出现了大量假冒伪劣产品[10]。目前,国内外蜂蜜鉴别技术主要分为:基础感官鉴别[11-14],如视觉感官、嗅觉感官、味觉感官;简单测试鉴别[15-16],根据简单反应原理加入试剂进行简单判别;仪器测定鉴别[17-18],如薄层色谱及高效液相色谱及生物显微镜检测,以及近红外光谱[19]等方法,但采用固相微萃取与气相色谱及质谱联用技术,并结合化学计量学方法对蜂蜜进行真假鉴别方面的研究未见报道。

固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)技术是20世纪90年代发展起来的一种样品分析前处理技术,该技术集采样、萃取、浓缩和进样于一体,简便、快速、经济安全、无溶剂、选择性好、且灵敏度高[20-21]。

本研究采用微固相萃取(SPME)分析技术,结合指纹图谱,主成分分析(PCA)、欧氏距离以及聚类分析等化学计量学方法,对野坝子蜂蜜与普通蜂蜜、不同产地的野坝子蜂蜜进行了系统研究，以期为市场中野坝子蜂蜜的真伪鉴别以及产地来源的评价提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜂蜜 云南白塔蜂业有限责任公司提供(大姚蜂蜜养殖场)不同批次野坝子蜂蜜,经鉴定为楚雄大姚野坝子蜂蜜;弥勒蜂蜜 养殖场提供不同批次野坝子蜂蜜,经鉴定为红河弥勒野坝子蜂蜜;不同批次的其他普通蜂蜜Ⅰ和普通蜂蜜Ⅱ 由云南白塔蜂业有限责任公司和弥勒蜂蜜养殖场提供;正己烷 色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;氘代甲苯 分析标准品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;癸醛 分析标准品,百灵威科技有限公司。

DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海右一仪器公司;7890A-5975C气相色谱质谱联用仪 美国Agilent公司;色谱柱 HP-INNOWAX(50 m×0.32 mm×0.25 μm,美国Agilent公司;萃取头 50/30DVB/CAR/PDMS,美国Supelco公司;CP2245电子天平 德国Sartorius公司;Milli-Q Integral 15超纯水仪 德国Merck Millipore DE公司;超声波清洗器 德国Elma公司;TG16-WS高速离心机 湖南湘立科学仪器有限公司;Phenom ProX电镜 复纳科学仪器上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂蜜花粉孢子学鉴定 取待分析的两种野坝子蜂蜜,各称取10 g,加入50 mL超纯水充分溶解后,取出10 mL于15 mL离心管中,放入离心机,8000 r/min离心4 min。倒出上清液,沉淀即为花粉,待花粉自然干燥后,扫描电镜进行微观形貌观察,每个被测样品随机选择10个视野进行观察,统计花粉粒数量,确定其种类,以形状相同数量最多的某种花粉粒定性。计算公式为:某种花粉粒(%)=10个视野中某种花粉粒个数/10个视野中花粉粒总数×100,某种花粉粒数目大于50%可认定为该种蜂蜜。采用楚雄产成熟期野坝子花粉进行扫描电镜微观形貌观察确定野坝子花粉标准图谱。

1.2.2 样品处理 分析方法按照文献所述方法[22-23],共取4种蜂蜜,每种蜂蜜不同批次各取一个样,取7次,共28个样。每个蜂蜜样品准确称量5 g蜂蜜加入2 mL(30 g/100 mL)食盐水放置于20 mL棕色顶空瓶中,SPME-GC-MS法测定时加入1 μL的氘代甲苯(正己烷溶)作为内标,随即旋紧瓶盖密封待测。

1.2.3 HS-SPME-GC/MS分析

1.2.3.1 仪器条件 固相微萃取条件:萃取温度:80 ℃,萃取时间:60 min,解吸附时间:30 min;取样针温度140 ℃;加热炉温度110 ℃;拔针时间0.5 min;操作模式:恒定。气相色谱[24]:进样口温度:250 ℃,分流进样,载气:氦气(99.99%),恒流流速1.0 mL/min,分流比:5∶1,升温程序:初始温度50 ℃,保持2 min,升温速率5 ℃/min至220 ℃,升温速率10 ℃/min至250 ℃,保持1 min。质谱条件:电离方式:EI+;离子源温度:230 ℃,传输线温度:250 ℃;扫描模式:全扫模式;扫描范围:40～350 amu;溶剂延迟:3.5 min。

1.2.4 特征性化合物确认 根据数据分析结果,确定特征性化合物,取癸醛标品,配成浓度为10 μg/mL标准溶液,采用1.2.3分析方法,对标品进行分析,并与蜂蜜样品进行比对。

1.3 数据处理

采用Chemmind Chempattern 2017 Pro软件进行主成分分析(PCA)分析、欧氏距离以及聚类分析。同时采用SIMCA、SPSS 23.0软件进行单因素方差分析、Fisher判别,对差异成分进行解析。

2 结果与分析

2.1 野坝子花粉孢子学鉴定

表3 不同蜂蜜HS-SPME-GC/MS数据Table 3 HS-SPME-GC/MS date of different honey

为提高分析结果准确性,确认野坝子蜂蜜来源可靠性,采用电镜对野坝子花粉蜂蜜进行孢子学鉴定。野坝子花粉电镜扫描结果见图1,该花粉形态赤道面观为长椭圆形,网脊细条纹状。野坝子蜂蜜鉴定结果见表1,经鉴定,来源于弥勒及大姚的两种野坝子蜂蜜确为该种蜂蜜,其余两种普通蜂蜜中野坝子含量分别为5%±0.04%、10%±0.01%,鉴定非野坝子蜂蜜。

图1 野坝子花粉电镜扫描图(1500×)Fig.1 Scanning electron microscopy(SEM)of the Elsholtzia rugulosa Hems L. pollen(1500×) 注:右上图为局部放大图(10000×)。

序号蜂蜜种类野坝子花粉占总花粉数(%)1野坝子蜂蜜(弥勒)62.00±0.032野坝子蜂蜜(大姚)71.00±0.013普通蜂蜜Ⅰ5.00±0.044普通蜂蜜Ⅱ10.00±0.01

2.2 野坝子蜜源产地特征

不同产地的野坝子药效成分和化学组成存在明显差异,从而进一步会对以其为蜜源的野坝子蜂蜜产生重要影响,因此,有必要对其产地进行梳理。表2为本研究所选的两个野坝子蜂蜜产地的经纬度,其中大姚土壤以红壤和黄壤为主,野坝子产地海拔多为1480～2800 m,pH在5.0～7.9,呈中性偏微酸性,有机质为2.0%～4.5%;气温低,降雨少,为滇中北部冷凉区[25-26]。弥勒主要为红壤,野坝子产地海拔多为1300～2300 m,pH在5.5～7.5,为中性偏微酸性,有机物含量1.2%～3.0%;肥力稍差,热量条件好,光照充足,为滇中部半干旱区[25-26]。因此,所选野坝子蜜源产地存在明显不同,为具有代表性的典型区域。

表2 野坝子蜂蜜产地经纬度Table 2 Longitude and latitude of the Elsholtzia rugulosa Hems L. honey producing areas

2.3 蜂蜜的HS-SPME-GC/MS分析

为了研究蜂蜜挥发性及半挥发性成分,采用HS-SPME-GC/MS对蜂蜜进行了分析。通过与标准谱库的比对检索,分别鉴定出近60种挥发性成分,通过数据分析处理,结果如表3所示。四种蜂蜜共检出64种成分,其中醇类有14种,醛类有11种,酚类1种,烷烃类5种,酸类8种,酯类16种,醚类1种,酮类5种,其他类3种,四种蜂蜜种均为醇类含量最多,醚类及酚类含量最少。弥勒产野坝子蜂蜜中α-异氟尔酮、丁香醇C、丁香醇D、α-甲基苯甲醇为特有成分,大姚产野坝子蜂蜜中γ-丁内酯、β-大马士酮、2-甲基萘、间苯二甲醛、月桂酸为特有成分,普通蜂蜜Ⅱ中对甲苯甲醚、茴香醛、对甲氧基苯乙酸乙酯、十八酸乙酯为特有成分,普通蜂蜜Ⅰ无特有成分。

续表

注:-:表示未检出。

2.4 不同蜂蜜指纹图谱分析及特征性化合物确认

在蜂蜜的HS-SPME-GC/MS数据中,以内标回收率最好的样品为基数,其他样品的内标峰面积与基数进行相比,得到这个比值为加权系数。利用公式:加权峰面积=原始积分峰面积/加权系数,对峰面积进行量化。将HS-SPME-GC/MS数据以CDF格式依次导入Chemmind Chempattern 2017 Pro专业版软件,按照以上方法量化各样品的峰面积,确定得到15个共有峰,建立蜂蜜样品的共有模式,

表4 不同蜂蜜的欧氏距离Table 4 Euclidean distances for different kinds of honey

注:表格中“-”表示离群数据已排除。

建立蜂蜜样品的化学指纹图谱叠加图,结果如图2所示。以四种蜂蜜所有色谱图建立共有模式,得到一个指纹图谱及15个共有峰,其共有峰对应的化学成分通过检索指认如图3所示。通过对蜂蜜化学指纹图谱[27-28]叠加图比对研究,结果表明在该分析方法下野坝子蜂蜜与普通蜂蜜的特征差异化学成分为癸醛和苯乙酸,可以作为野坝子区别普通蜂蜜的特征化学成分。并对特征性化合物进行确认,分析结果显示:癸醛标准品保留时间为19.701 min,定性离子:112/57；苯乙酸标准品保留时间为46.243 min，定性离子：136/91。野坝子蜂蜜(弥勒)保留时间为19.698 min,野坝子蜂蜜(大姚)保留时间为19.702 min时对应出峰位置均出现定性离子(112/57),说明该化合物为癸醛；野坝子蜂蜜(弥勒)中苯乙酸保留时间为46.240 min，野坝子蜂蜜(大姚)中苯乙酸保留时间为46.245 min时对应出峰位置均出现定性离子(136/91)，说明该化合物为苯乙酸。

图2 蜂蜜的HS-SPME-GC/MS叠加图Fig.2 Stacking chromatograms of honey’s HS-SPME-GC/MS 注:右上图为局部放大图。

图3 蜂蜜的指纹图谱及其共有峰Fig.3 Honey’s fingerprint and its common peak 注:1.乙醇;2.反式氧化芳樟醇;3.顺式氧化芳樟醇; 4.壬酸乙酯;5.脱氢芳樟醇;6.苯乙醇; 7.辛酸;8.三乙酸甘油酯;9.壬酸;10. 棕榈酸乙酯; 11.2,4-二甲基苯乙酮;12.癸酸; 13.二十三烷;14.苯甲酸;15.油酸乙酯。

图4 不同蜂蜜的主成分分析图Fig.4 Principal component analysis of different honey

2.5 不同蜂蜜的主成分分析

为了直观地对不同蜂蜜进行区分,将HS-GC/MS数据导入软件ChemPattern 2017 Pro,进行主成分分析。如图4所示,为不同蜂蜜的主成分分析图。图中X轴为每个样品的第一主成分得分,Y轴为每个样品的第二主成分得分。第一主成分贡献率为88.43%,第二主成分贡献率为7.24%,其总贡献率为95.67%,接近100%,表明1类主成分对所有指标的代表性较强。两个野坝子蜂蜜位置接近,同时与普通蜂蜜可以明显分开,具有较好的区分效果。表明2 个产地的野坝子蜂蜜挥发性成分具有大量的共有成分,而与普通蜂蜜挥发性成分的组分和含量上存在明显的差异性。因此,可以利用SPME-GC/MS结合PCA主成分分析对野坝子蜂蜜进行真伪鉴别。

2.6 不同蜂蜜的欧氏距离及聚类分析

欧氏距离的大小与其相似程度相关,通常相似度越大的样本其欧氏距离接近,且归为一类的可能性越大。表4为不同蜂蜜的欧氏距离数据,由表4可知,野坝子蜂蜜的欧氏距离为0.42～0.49,与所选的普通蜂蜜的欧氏距离区别明显。

聚类分析是一种根据样本的相似程度进行归类的方法,目前在中草药材质量评价、产地品种分类、真伪鉴别等方面应用广泛。它是根据观察值或变量之间的相似程度,将最为相似的样品结合在一起,以逐次聚合的方式将样品聚类,直到最后所有样品都聚成一类。一般临界值越小,表明样品越相似。将HS-GC/MS数据导入软件ChemPattern 2017 Pro,对蜂蜜样品进行系统聚类分析,所得结果如图5所示。临界值处于7.0～10.0时,四类蜂蜜可以明显进行区分,临界值10.0～10.5时,整个蜂蜜样品可以分为两类,即野坝子蜂蜜和普通蜂蜜。

图5 不同蜂蜜的聚类分析图Fig.5 Cluster analysis of different kinds of honey

欧氏距离、聚类分析结果与主成分分析结果一致,表明野坝子蜂蜜与普通蜂蜜挥发性成分具有明显差异,其结果对野坝子蜂蜜与普通蜂蜜真伪鉴别具有一定的指导性作用。

2.7 野坝子蜂蜜的Fisher判别

表7 验证样本与重心的距离计算值及判别结果Table 7 The calculated value of the distance between the validation sample and the center of mass and results of discrimination

上述研究表明野坝子蜂蜜与普通蜂蜜存在明显的区别,为了对野坝子蜂蜜与普通蜂蜜进行进一步区别,通过筛选特定化学成分作为指标,构建Fisher函数实现野坝子蜂蜜的类别判别。其基本思想是先根据类间距离最大、类内距离最小的原则确定线性判别函数,再用此函数判定待判样品的类别判别[29]。

选择SPME-GC-MS图谱中的15 个共有峰的面积为变量,建立四种蜂蜜的 Fisher 判别函数。在 27 个蜂蜜样品中(7个弥勒野坝子蜂蜜,7个大姚野坝子蜂蜜,7个普通蜂蜜Ⅰ,6个普通蜂蜜Ⅱ),随机抽取的 5 份样品(S3,S9,S12,S19和S25)为验证样本;其余 22 份蜂蜜样品为模型样本,进行 SPSS 判别分析。使用逐步判别筛选对判断分类有明显作用的变量,筛选出的变量为:X2(反式氧化芳樟醇)、X3(顺式氧化芳樟醇)、X4(壬酸乙酯)、X5(脱氢芳樟醇)、X6(苯乙醇)。对应的22 份蜂蜜已知样品的非标准化 Fisher 判别函数为:

Z1=3.943+0.746X2-1.234X3-0.796X4+0.064X5+0.038X6(方差解释率61.0%)

Z2=-2.594+2.535X2-5.009X3-0.073X4-0.032X5+0.017X6(方差解释率37.4%)

Z3=-5.254+1.438X2-3.376X3+0.349X4+0.084X5+0.009X6(方差解释率1.6%)

将上述5份蜂蜜验证样本的5个共有成分代入Fisher判别函数计算,计算结果见表5;组质心处的函数见表6,反映各类别在空间坐标中的位置,并计算分别离各重心的距离,其距离计算值与某种蜂蜜重心距离最近数值最小者可判别为该种蜂蜜,以此为判别依据对五个验证样本进行分类,结果如表7所示。该判别结果与实际情况相符,符合率达100%。

表5 验证样本的判别函数值Table 5 Discriminant function value of validation samples

表6 组质心处的函数Table 6 Functions at the center of mass of the group

2.8 不同产地野坝子蜂蜜的差异成分研究

上述PCA、欧氏距离、聚类分析以及Fisher类别判定研究表明,野坝子蜂蜜与普通蜂蜜存在明显差异,同时两个代表性产地的野坝子蜂蜜也存在一定差异。为了实现不同产地野坝子蜂蜜的识别及质量控制,对云南省两个代表性野坝子蜂蜜产地野坝子蜂蜜差异成分进行研究,采用显著性P值对其差异成分进行研究。将HS-GC/MS数据导入SIMCA软件,计算不同挥发性成分的P值,结果如表3所示。当P<0.05时,认为其有显著性差异,通过对表3的P值分析,表明化学成分丁香醇C、间苯二甲醛、丁香醇D等42个成分存在显著差异(P<0.05)。说明2个代表性产地野坝子蜂蜜成分差异明显,风格差别显著,这可能与其产地特征差异所造成的。其中丁香醇C、间苯二甲醛、丁香醇D、月桂酸乙酯、α-异氟尔酮、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、异丁醇、2-甲基丁醇等9个成分的F值较大,可作为2个代表性产地野坝子蜂蜜样品间的主要差异成分。

3 结论

野坝子蜂蜜作为具有保健功能的云南特色优质蜂蜜,市场上假冒伪劣产品较多。本研究首次采用HS-SPME-GC/MS检测结合化学计量学数据分析手段,根据其共有指纹图谱进行筛选出癸醛和苯乙酸为野坝子蜂蜜的特征物质,同时对四种蜂蜜作PCA及聚类分析,并根据指纹图谱所确定共有色谱峰构建Fisher函数作为判别依据,实现了野坝子蜂蜜与普通蜂蜜快速准确鉴别,一种检测手段结合多种数据分析方法同时鉴别,其结果可进行相互验证,对特征物质选择及野坝子蜂蜜与普通蜂蜜真伪鉴别具有一定的指导性作用。同时,采用F检验进行分析,表明2个代表性产地野坝子蜂蜜成分差异明显,同时对差异性成分进行分析,这可能是由于产地特征差异造成的。本实验不仅实现了野坝子蜂蜜的鉴别,而且提高了不同种蜂蜜或不同产地同种蜂蜜的鉴别准确性,为不同产地野坝子蜂蜜来源产地识别及质量控制的评价提供技术支持。