黑豆添加微量元素发芽后对雌性大鼠更年期综合征的影响

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(1.山东中医药大学药学院,山东济南 250355; 2.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司,山东德州 251200)

女性更年期综合征是指女性在绝经前后,由于性激素含量的减少导致的一系列精神及躯体表现,如植物神经功能紊乱、生殖系统萎缩等,还可能出现一系列生理和心理方面的变化,如焦虑、抑郁和睡眠障碍等,严重影响自己和他人的工作和生活[1]。

大豆异黄酮因具有植物类雌激素作用,近年来越来越引起国内外学者们的注意,其对妇女更年期综合征有较好的治疗作用[2-3]。张晓鹏等[4]设计了雌激素低下模型,模拟更年期潮热症状,通过选用不同剂量的大豆异黄酮对该模型进行验证,结果表明大豆异黄酮能够在一定程度上改善该模型造成的更年期综合征。针对妇女更年期综合征的主要并发症绝经期骨质疏松症,学者们从临床的角度,证实了大豆异黄酮通过增加更年期患者的骨密度来有效改善妇女更年期综合征症状[5-6]。温少霞等[7]通过对更年期综合征患者补充大豆异黄酮50～150 mg/d,表明大豆异黄酮可缓解消除妇女更年期综合征的各症候群。

研究表明,锌、锰、铜、铁等微量元素均能提高大豆异黄酮的含量[8]。此外,经查阅文献发现,大量更年期综合征患者的血清中锌、锰、铜、铁含量均明显偏低[9-10],提示微量元素的缺失可能是发病原因之一。调查中还发现,补肾常作为治疗更年期综合征的基础疗法,对该现象进行研究,发现补肾中药及复方中含有大量人体所必需的微量元素,尤其以锌、锰、铜、铁的含量最为显著[11],这就从微量元素方面,证明了更年期综合征可用补肾中药治疗是正确的。“黑豆入肾功多”,自古以来就有补肾的功效,且黑豆中含有的异黄酮成分,已被研究证实能够有效地消除妇女更年期的不适,广泛用于妇女更年期综合征的治疗[12]。翟玮玮等[13]研究发现,黑豆发芽使得蛋白质含量增加的同时,其平均分子量也下降。生物代谢实验证明,物质是以小分子的形式被人体吸收利用的[14]。由此可见,黑豆经发芽处理后更易于为人体所吸收,从而提高其营养价值。目前,研究黑豆通过添加微量元素发芽提高黑豆的营养价值,及对更年期综合征影响的文献较少。

因此,本研究以健康雌性SD大鼠为实验动物,制备摘除卵巢的大鼠(去势大鼠)动物模型,通过添加锌、锰、铜、铁四种微量元素,创新发芽方式,考察黑豆添加微量元素发芽后对摘除卵巢的雌性大鼠生殖内分泌的影响,以期为黑豆添加微量元素发芽应用于更年期综合征的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级SD雌性大鼠 使用孕产后雌性大鼠,体重(415±30) g,70只,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(动物许可证号:SCXK(鲁)2014-0007),饲养环境:室温23～25 ℃,相对湿度35%～65%;黑豆 生品,黑龙江牡丹江市;乙醇 分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;硫酸锌 分析纯,天津市永大化学试剂开发中心;硫酸锰 分析纯,天津博迪化工股份有限公司;硫酸铜 分析纯,天津市鼎盛鑫化工有限公司;硫酸亚铁 分析纯,天津市福晨化学试剂厂;吐温-80(P1751) 美国Sigma公司;水 均为蒸馏水,自制;雌二醇(E2)放射免疫试剂盒(批号20180119)、卵泡刺激素(FSH)放射免疫试剂盒(批号20180119) 北京华英生物技术研究所;己烯雌酚片(H44024916) 广东华南药业集团有限公司;10%水合氯醛 自制。

FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;CN-A320B型豆芽机 佛山市顺德区嘉壕实业有限公司;XH-6020全自动放免计数仪 西安核仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 药物的制备

1.2.1.1 生黑豆 将黑豆粉碎后,过80目筛,得到生黑豆粉,加1%吐温-80配制成生黑豆组的药物溶液。

1.2.1.2 清水发芽黑豆 将黑豆用蒸馏水洗净表面,用75%乙醇溶液消毒10 min,洗至无醇味,25 ℃避光条件下用蒸馏水浸泡6 h,取出,再次用蒸馏水将泡发的黑豆种子清洗干净,置于豆芽机中,25 ℃环境温度下以水喷洒发芽,至芽长12 cm,将发芽黑豆50 ℃烘箱中烘干,粉碎后,过80目筛,得到清水发芽黑豆粉,加1%吐温-80配制成清水发芽黑豆组的药物溶液。

表1 大鼠用剂量换算Table 1 Rat dose conversion

1.2.1.3 添加微量元素发芽黑豆 同1.2.1.2项下的制备方法,把浸泡及喷洒发芽用的蒸馏水换成含硫酸锌30 mg/L、硫酸锰20 mg/L、硫酸铜10 mg/L、硫酸亚铁20 mg/L的混合溶液。置于豆芽机中,25 ℃环境温度下喷洒发芽,至芽长12 cm,将微量元素发芽黑豆50 ℃烘箱中烘干,粉碎后,过80目筛,得到添加微量元素发芽黑豆粉,加1%吐温-80配制成清水发芽黑豆组的药物溶液。

1.2.2 造模方法 实验前,将健康雌性大鼠放置在动物房里,适应环境3 d用10%水合氯醛液对大鼠进行腹腔麻醉注射后,仰卧位固定大鼠,切开腹腔,找到卵巢。剪取时,先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用丝线结扎,再摘除卵巢,术后顺势将子宫宫角送回腹腔中,然后放入适量的青霉素以预防感染。同法摘除另一侧卵巢。

1.2.3 分组与给药 SD雌性大鼠共70只,取10只为正常组,剩余60只进行卵巢摘除造模,随机分为6组,分别为模型组、阳性药组(己烯雌酚)、生豆组、清水发芽组(以下称清水组)、添加微量元素发芽低剂量组(以下称富微低组)、添加微量元素发芽高剂量组(以下称富微高组),每组10只。除正常组、模型组灌胃蒸馏水(按1 mL/100 g动物体重灌胃)外,其余剂量换算按实验动物与人体重等效量换算[15-19]。

1.2.4 实验动物与人体重等效量换算 计算公式如下。

式中:D(a)表示大鼠用剂量,mg/kg;D(b)表示成人每天服用剂量,mg/d;K表示换算系数6.3;W表示人体标准重量,60 kg。

按上述计划,在造模后即日开始给药,按1 mL/100 g动物体重灌胃,1次/d,连续给药6周(42 d)。

1.2.5 指标检测

1.2.5.1 阴道上皮细胞角化实验 分别于给药周期的最后5 d,于每日给药后2 h(可固定适宜的时间,即确保同一时间)进行大鼠阴道涂片检查。具体方法如下:用预先浸有0.9%生理盐水的棉签,轻轻插入阴道2～3 cm,以适当的力度轻刮阴道前壁,将棉签在标有编号的载玻片上向一个方向滚涂,自然风干后以5%美蓝溶液染色10 min,接着用水轻轻冲去多余的染色液,再次自然风干,阴道涂片即制作完成[20]。显微镜下观察去势大鼠阴道涂片,并记录最后一天角化上皮细胞、上皮细胞、白细胞含量数据。

1.2.5.2 血清性激素(E2、FSH)的测定 末次给药前禁食12 h给药后1 h,麻醉大鼠,腹主动脉取血后室温下静置,以1000 r/min下离心10 min,取血清,以Elisa法检测各组血清性激素表达水平。

1.2.5.3 子宫病理切片观察 将子宫组织分别固定在10%甲醛溶液中,依次进行常规脱水、石蜡包埋、切片、普通HE染色,在光学显微镜下观察大鼠子宫形态。

1.3 数据处理

统计分析使用SPSS 17.0软件,实验数据采用X±SD表示,P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 饲喂富微发芽黑豆粉对去势更年期模型大鼠角化上皮细胞、上皮细胞、白细胞含量的影响

与正常组相比,模型组阴道角化上皮细胞含量极显著降低86%(P<0.01),阴道上皮细胞角化程度与体内雌激素水平成正比,所以阴道上皮细胞角化程度间接地说明雌激素活性的大小,说明摘除卵巢致更年期综合征大鼠造模成功,且不影响大鼠生命。同时与正常组相比,模型组的白细胞含量极显著升高1233%(P<0.01),上皮细胞含量极显著降低96%(P<0.01)。

与模型组相比,生豆组能极显著升高角化上皮细胞含量与上皮细胞含量281%、1125%(P<0.01),显著降低白细胞含量38%(P<0.05);与模型组相比清水组能极显著升高角化上皮细胞含量与上皮细胞含量362%、675%(P<0.01),显著降低白细胞含量68%(P<0.05);与模型组相比,富微低组能极显著升高角化上皮细胞含量与上皮细胞含量455%、2100%(P<0.01),显著降低白细胞含量52%(P<0.05)。与模型组相比,富微高组能极显著升高角化上皮细胞含量与上皮细胞含量466%、1650%(P<0.01),显著降低白细胞含量61%(P<0.05)。各组对去势更年期模型大鼠的角化上皮细胞含量升高作用表现为:富微高组>富微低组>清水组>生豆组。对上皮细胞含量升高作用表现为:富微低组>富微高组>生豆组>清水组。对白细胞含量降低作用表现为清水组>富微高组>富微低组组>生豆组。据报道[21],大鼠阴道内容物主要由角化上皮细胞、上皮细胞、白细胞组成,角化上皮细胞的增加说明大鼠雌激素活性增加。此实验结果说明黑豆能有效改善更年期症状,与黑豆中的大豆异黄酮有关。

表2 角化上皮细胞含量、上皮细胞含量、白细胞含量(X±SD)Table 2 Contents of keratinized epithelial cells,epithelial cells and white blood cells(X±SD)

注:与正常组相比,#:P<0.05,##:P<0.01;与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01;与生豆组相比,a:P<0.05;与清水组相比,b:P<0.05,bb:P<0.01;与阳性药组相比,c:P<0.05,cc:P<0.01;与富微低组相比,d:P<0.05;下同。

与生豆组相比,清水组能显著升高角化上皮细胞含量21%(P<0.05),显著降低上皮细胞含量与白细胞含量37%、48%(P<0.05);富微低组与生豆组相比,能显著升高角化上皮细胞含量46%(P<0.05),显著降低白细胞含量23%(P<0.05),显著升高上皮细胞含量44%(P<0.05);富微高组与生豆组相比,能显著升高角化上皮细胞含量48%(P<0.05),显著降低白细胞含量37%(P<0.05),显著升高上皮细胞含量43%(P<0.05)。此实验说明黑豆发芽12 cm后,比没有发芽的黑豆对去势更年期模型大鼠的雌激素活性增加,这是因为发芽后黑豆中大豆异黄酮含量增加,大豆异黄酮能够在一定程度上改善该模型造成的更年期综合征。

与清水组相比,富微低组能显著升高角化上皮细胞含量19%(P<0.05),显著升高白细胞含量49%(P<0.05),极显著升高上皮细胞含量184%(P<0.01);富微高组与清水组相比,能显著升高角化上皮细胞含量22%(P<0.05),显著升高白细胞含量22%(P<0.05),极显著升高上皮细胞含量126%(P<0.01)。此实验说明在发芽过程中添加微量元素能够使黑豆中大豆异黄酮含量增加,从而使更年期模型大鼠的雌激素活性增加。

与阳性药组相比,富微低组显著降低了角化上皮细胞含量14%(P<0.05),极显著升高了白细胞含量92%(P<0.01);富微高组显著降低了角化上皮细胞含量12%(P<0.05),显著升高了57%白细胞含量(P<0.05)。此实验说明,富微发芽黑豆能使去势更年期模型大鼠的雌激素活性增加,但与阳性药组相比,还有一定差距。

与富微低组相比,富微高组角化上皮细胞含量没有显著性差异;白细胞含量显著降低了18%(P<0.05),上皮细胞含量显著降低20%(P<0.05)。此实验说明,高剂量富微发芽能使去势更年期模型大鼠的炎症减轻,但对去势更年期模型大鼠的雌激素活性与富微低组没有差异。

2.2 饲喂富微发芽黑豆粉对去势更年期模型大鼠血清性激素(E2、FSH)的影响

由表3可知，与正常组相比,模型组大鼠的E2值显著降低68%(P<0.05),FSH显著升高28%(P<0.05)。与模型组相比,生豆组E2极显著升高85%(P<0.01),FSH极显著降低12%(P<0.01)。清水组、富微高组、富微低组与模型组相比,E2没有升高反而降低。清水组与模型组相比对FSH没有显著影响。富微高组、富微低组与模型组相比FSH分别显著降低10%、14%(P<0.05)。根据前人的研究得出[22],更年期妇女由于机体植物神经失调,卵泡性激素下降导致E2水平下降,FSH水平上升,常产生焦虑、烦躁、抑郁等不良心理,用药后E2升高,随E2增加达一定水平时,又反馈性抑制FSH分泌。本实验在检测过程中发现清水组、富微高组、富微低组与模型组相比E2没有升高反而降低,其原因可能是发芽后增加的大豆异黄酮不是影响E2与FSH水平的因素,或可能是实验模型或实验对象不同导致与前人的结果有差异。

表3 血清性激素(E2、FSH)含量测定(X±SD)Table 3 Content determination of serum sex hormones(E2,FSH)(X±SD)

与生豆组相比,清水组、富微低组、富微高组不能使E2增加,FSH没有显著性差异。与清水组相比,富微低组能显著升高E245%(P<0.05),FSH没有显著性差异;富微高组与清水组相比E2、FSH没有显著性差异。与阳性药组相比,富微高组与富微低组不能使E2增加,FSH没有显著性差异。与富微低组相比,富微高组不能使E2增加,FSH没有显著性差异。

2.3 子宫病理切片结果

子宫病理切片显微照片见图1。在100倍镜头下可以看到,正常组子宫内膜厚度减少,子宫腺体数量减少,形成较多显微组织增生和细胞间质;模型组子宫内膜厚度变薄,大量炎性细胞侵润,平滑肌增生明显,且排列无序,子宫腺体数量明显减少,形成较多显微组织增生和细胞间质,或见到空泡状的腺体;阳性药组子宫内膜厚度增加,炎性细胞浸润减少,平滑肌增生减少,排列致密,子宫腺体数量略有增加,显微组织增生和细胞间质现象减少;生豆组子宫内膜厚度未见明显变化,炎性细胞浸润有所减少,子宫腺体数量较少,显微组织增生和细胞间质现象未有减少;清水组子宫内膜厚度有所增加,显微组织增生和细胞间质现象未有减少,腺体周围炎性浸润明显,局部观察到平滑肌增生明显,排列致密;富微低组子宫内膜明显厚度增加不明显,炎性细胞浸润未获明显的减轻,显微组织增生和细胞间质现象未有减少,腺体周围炎性浸润明显,局部观察到平滑肌增生明显,排列致密;富微高组子宫内膜明显增厚,炎性细胞浸润有所减轻,腺体数量增多,腺体周围炎性浸润减轻,平滑肌排列致密,病理性增生减少。

图1 大鼠子宫病理切片(HE染色,100×)Fig.1 Uterine pathological section of rats(HE staining,100×) 注:1:正常组;2:模型组;3:阳性药组;4:生豆组; 5:清水组;6:富微低组;7:富微高组。

3 讨论与结论

微量元素对人体具有十分重要的作用,为人体健康所必需。如果体内缺少某些微量元素,可以引起相应的疾病,因此不少疾病的发生发展与体内微量元素有明显的直接关系。而更年期患者血清中锌、锰、铜、铁含量均明显偏低[23]。大豆异黄酮在改善更年期综合征症状的作用很明显,尤其是在改善潮热出汗和失眠作用更为突出。本研究通过添加微量元素发芽提高黑豆中大豆异黄酮的含量,研究黑豆添加微量元素发芽后对雌性大鼠更年期综合征的影响。结果显示,给摘除卵巢的大鼠灌胃添加微量元素发芽至12 cm的黑豆芽粉后,与模型组相比,富微高组与富微低组均能使阴道角化上皮细胞含量极显著升高(P<0.01),各组对角化上皮细胞含量升高效果表现为富微高组>富微低组>清水组>生豆组,且富微高组与富微低组均能使摘除卵巢的大鼠子宫内膜厚度明显增厚,腺体数量增多,病理性增生减少,炎性浸润减轻。

本文在本团队的研究基础[24]上,通过添加锌、锰、铜、铁四种微量元素,创新采用发芽有机转化的方式,既提高了黑豆中对更年期综合征有确切疗效的异黄酮苷元的含量(另文详述),又增加了微量元素的摄入量,提升了黑豆的营养价值。本文研究可为黑豆富微发芽应用于更年期综合征的治疗提供实验依据。