阿魏酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤的保护作用△

朱德军 王潇飞 薛中淇 扈晓雯 夏明芳 冶敏 王力 邹文青

糖尿病是由遗传和环境因素相互作用，以高血糖为主要特征的一种慢性代谢性疾病[1]。目前糖尿病已成为除肿瘤、冠心病、脑血管病之外第四大威胁人类健康的慢性疾病[2]。有研究报道，我国糖尿病患病率已从1980年的0.67 % 上升至2013年的 10.4 %，是糖尿病患者人数最多的国家之一[3]。糖尿病性白内障(diabetic cataract,DC)已成为糖尿病并发症中仅次于视网膜

病变的第二大眼病，研究发现，晶状体上皮细胞(LEC)凋亡在DC的发生发展中发挥着重要作用[4]。阿魏酸是从阿魏、川芎、木贼、升麻等多种中药中提取出的有效单体，具有较强的抗氧化能力，在抗肿瘤、抗氧化、解毒、保肝等方面发挥着巨大的作用，因其性质稳定、毒性低受到人们的广泛关注[5]。本研究以人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLEC)为研究对象，观察阿魏酸对高糖诱导的HLEC损伤是否具有保护作用，为阿魏酸的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料HLEC(上海中乔新舟生物技术有限公司)；抗p53抗体、抗Bcl-2抗体(美国Abcam公司)；抗Bax抗体(中国武汉Proteintech公司)；内参β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；Cell Counting Kit-8(日本Dojindo Laboratories公司)；细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物技术有限公司)；总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；第一链cDNA合成试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；Q-PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)；二甲基亚砜(dimothyl sulfoxide，DMSO；北京Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组细胞培养条件：上皮细胞培养基，包括：500 mL基础培养基、10 mL胎牛血清、5 mL上皮细胞生长因子、5 mL青霉素/链霉素溶液；在37 ℃、含体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养，每2～3 d传代一次。实验用细胞均处于对数生长期。将阿魏酸、生理盐水、1 g·L-1DMSO配制成 2 g·L-1阿魏酸混悬液，其中1 g·L-1DMSO为助溶剂。将实验对象分为对照组(HLEC+DMEM)、DMSO组(HLEC+DMEM+DMSO)、高糖组(HLEC+DMEM+30 mmol·L-1高糖)、高糖+阿魏酸组(HLEC+DMEM+DMSO+30 mmol·L-1高糖+阿魏酸)，为寻找最佳的阿魏酸浓度，高糖+阿魏酸组中阿魏酸浓度分别设为200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、500 μmol·L-1、700 μmol·L-1进行比较，选择使细胞活性增强最为显著的阿魏酸浓度组进行下一步实验。

1.2.2 CCK-8法检测HLEC增殖情况通过倒置显微镜观察HLEC生长状态并放置超净工作台内，经过无菌PBS 冲洗、2.5 g·L-1胰蛋白酶消化、培养基工作液对抗、离心，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，37 ℃、含体积分数5%CO2的环境孵育过夜；每板分别按照实验分组设置相应浓度工作液，每组设定5个复孔，37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱孵育24 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h；450 nm波长下测定各孔的吸光度(A)值。计算各组(1.2.1分组中除DMSO组外)的细胞活性，细胞活性=A处理组/A样品对照组×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡取出培养完毕的细胞，PBS漂洗2遍，用2.5 g·L-1不含EDTA和酚红的0.5 mL胰蛋白酶进行消化，吹打混匀成单细胞悬液，离心后弃去上清液；将细胞悬液移至5 mL圆底离心管内，1000 r·min-1离心5 min，弃去上清液；预冷PBS 2 mL洗涤1次，轻轻混匀，离心后弃上清，重复两次，用400 μL Annexin V结合液悬浮细胞，避光加入5 μL FITC染色液，4 ℃避光放置 15 min，避光加入10 μL PI染色液再次混匀，置于 4 ℃ 冰箱内避光孵育5 min；使用流式细胞仪488 nm的波长条件下上机检测对照组、高糖组、高糖+阿魏酸组细胞凋亡率。

1.2.4 Q-PCR检测细胞中p53、Bcl-2、Bax mRNA表达收集DMSO组、高糖组、高糖+阿魏酸组和对照组的细胞，采用Trizol一步法从HLEC中提取总RNA，逆转录酶逆转录合成cDNA，取逆转录产物2 μL作为模板，以GAPDH为内参应用Q-PCR仪(伯乐CFX96)进行扩增。p53、Bcl-2和Bax部分片段的引物采用Premier 5.0 软件进行设计。p53上游引物为5’-GAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3’，下游引物为5’-TCCGTCCCAGTAGATTACCAC-3’；Bcl-2上游引物为5’-GATTGTGGCCTTCTTTGAGTTC-3，下游引物为5’-ACTGAGCAGAGTCTTCAGAGACA-3’；Bax上游引物为5’- AGCTCTGAGCAGATCATGAAGAC-3’，下游引物为5’-AGTTGAAGTTGCCCTCAGAA-AAC-3’；GAPDH上游引物为5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物为5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s共40个循环，最后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存，采用2-ΔΔCt方法表示p53、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量，实验重复 3 次后进行统计分析。

1.2.5 Western blot 法检测细胞中p53、Bcl-2、Bax蛋白表达检测DMSO组、高糖组、高糖+阿魏酸组和对照组蛋白表达。细胞培养皿弃去上清液，PBS清洗4遍，刮取细胞；加入蛋白裂解液，振荡离心 30 s，冰上静置5 min，重复4次，12 000 r·min-1离心15 min后取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。100 ℃、10 min蛋白变性、电泳、转膜，100 g·L-1脱脂奶粉封闭1.5 h，加一抗4 ℃过夜，第2天复温 1 h，加二抗37 ℃振荡孵育1 h，TBST漂洗3次，加入超敏ECL化学发光剂显影。以β-actin为内参，采用 Image J 图像处理系统计算各样本条带与内参条带的灰度值比值。

1.2.6 免疫细胞化学检测细胞中p53、Bcl-2、Bax蛋白表达DMSO组、高糖组、高糖+阿魏酸组和对照组细胞爬片，PBS清洗3次，40 g·L-1多聚甲醛固定10 min，Triton-100孵育20 min，体积分数3%双氧水15 min，血清工作液封闭30 min，一抗孵育4 ℃过夜，PBS代替一抗作为阴性对照，二抗孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，封片。阳性反应为棕黄色或黄色颗粒。采用Image-ProPlus 6.0图像分析软件，检测p53、Bcl-2和Bax阳性细胞平均A值，以间接反映p53、Bcl-2和Bax蛋白的表达量，重复测量3次，取其均值。

1.3 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料均采用均数±标准差表示，两组样本均数间比较采用t检验，多组样本均数间比较采用方差分析，多组组内两两比较采用LSD法。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 CCK-8法检测HLEC活性CCK-8法检测结果显示，高糖组HLEC细胞活性为(44.01±1.63)%，较对照组(92.11±8.00)%明显降低(P<0.05)，200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、500 μmol·L-1、700 μmol·L-1阿魏酸溶液干预24 h后，细胞活性分别为(53.30±1.94)%、(64.46±1.28)%、(76.27±2.34)%、(66.70±0.84)%，均较高糖组增强(均为P<0.05)，其中加入500 μmol·L-1阿魏酸溶液时，细胞活性增强最为显著，后续实验中阿魏酸浓度选择500 μmol·L-1。

2.2 流式细胞术检测各组细胞凋亡对照组、高糖组、高糖+阿魏酸组细胞凋亡率分别为(2.63±0.63)%、(28.42±0.97)%、(17.23±1.33)%，差异具有统计学意义(F=484.716，P<0.01)；与对照组相比，高糖组与高糖+阿魏酸组细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与高糖组相比，高糖+阿魏酸组细胞凋亡率减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.3 Q-PCR检测各组细胞p53、Bcl-2、Bax mRNA表达情况GAPDH在不同样本中的扩增曲线和熔解曲线见图2。内参GAPDH基因在各个样本中扩增效果良好。各组 p53、Bcl-2、Bax mRNA扩增曲线和熔解曲线见图3、图4、图5。各组间p53、Bcl-2、Bax mRNA表达水平差异均具有统计学意义(F=229.839、569.074、300.261，均为P<0.01)。组内两两比较，高糖组p53 mRNA表达水平高于其他处理组，与其他组Bcl-2、Bax mRNA表达水平差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；高糖+阿魏酸组Bcl-2 mRNA表达水平高于其他处理组(均为P<0.05)。见图6。

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

图2 GAPDH 扩增和熔解图 A：扩增曲线；B：熔解曲线

图3 p53 mRNA扩增和熔解图 A：扩增曲线；B：熔解曲线

图4 Bcl-2 mRNA 扩增和熔解图 A：扩增曲线；B：熔解曲线

图5 Bax mRNA 扩增和熔解图 A：扩增曲线；B：熔解曲线

2.4 Western blot 法检测HLEC p53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况各组间p53、Bcl-2、Bax蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=109.197、138.223、6.289；均为P<0.05)。组内两两比较，高糖+阿魏酸组p53、Bax蛋白表达水平均明显低于高糖组(均为P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达水平明显高于高糖组(P<0.05)。见表1与图7。

图6 Q-PCR检测各组p53、Bcl-2、Bax mRNA表达情况 1：对照组；2：DMSO组；3：高糖组；4：高糖+阿魏酸组；与对照组相比，*P<0.05；与高糖组相比，#P<0.05

2.5 免疫细胞化学检测HLEC中p53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况高糖组p53、Bax 蛋白表达水平均明显高于其他三组，差异均有统计学意义(F=137.706、95.330；均为P<0.01)，而Bcl-2蛋白表达水平明显低于其他三组，差异有统计学意义(F=39.068，P<0.01)。见图8与表2。

表1 Western blot 法检测各组p53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

注:与对照组相比，*P<0.05；与高糖组相比，#P<0.05

图7 Western blot 法检测HLEC中p53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

图8 免疫细胞化学检测HLEC中p53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

表2 免疫细胞化学检测各组p53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

注:与对照组相比，*P<0.05；与高糖组相比，#P<0.05

3 讨论

随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，我国糖尿病发病率呈逐年上升趋势[6]，DC是最常见的糖尿病眼部并发症，也是糖尿病患者致盲的主要原因之一，且目前尚无有效的治愈方法[7-8]。近年来研究发现，DC发病可能与晶状体抗氧化体系紊乱和氧化损伤密切相关[9]，LEC是晶状体代谢最活跃的部位，可产生晶状体纤维维持整个晶状体的代谢，在保持晶状体透明性上发挥着重要作用，正常的LEC内几乎无凋亡细胞，而DC患者LEC内可见大量凋亡细胞，因此LEC凋亡可能是所有非先天性白内障形成的细胞学基础[10]。最新研究发现，阿魏酸可通过抑制机体氧化应激，降低淀粉样蛋白在HLEC中的聚集，从而达到抑制白内障患者晶状体混浊的作用[11]。因此，本研究以HLEC为研究对象，探讨阿魏酸对高糖诱导的HLEC损伤是否具有保护作用，为阿魏酸的临床应用提供一定的理论依据。

牛欢等[12]研究发现，高糖可能通过诱导细胞内线粒体ROS的增加，进而造成HLEC的氧化损伤，导致细胞凋亡。本研究发现，葡萄糖溶液刺激HLEC 24 h后，细胞活性明显降低，阿魏酸溶液干预后，HLEC细胞活性明显升高，其中500 μmol·L-1阿魏酸溶液干预效果最为明显。流式细胞术检测结果显示，高糖组HLEC凋亡率较对照组明显增加，阿魏酸干预后细胞凋亡率明显减少，提示高糖可诱导HLEC凋亡，阿魏酸可抑制高糖引起的HLEC氧化损伤，减少LEC凋亡，证明阿魏酸或许可以预防DC的发生。

近年来，p53逐渐在糖尿病和癌症发展中成为研究的热点。有研究报道，正常HLEC中未见 p53 蛋白表达，而糖尿病模型组中可见p53蛋白表达，p53 蛋白可能促进了 LEC 凋亡，导致晶状体混浊[13]。此外，p53 可以转录活化Bax靶基因而抑制 Bcl-2的转录，进而激活 Bax，诱导 Bax 寡聚，也可以将 Bax直接从 Bax-Bcl 的复合物中置换出来，进而促进细胞凋亡[14]。本实验结果显示，高糖组p53 mRNA和蛋白表达量明显高于对照组，尤其以细胞核内增强为主，并伴随Bax表达增高和Bcl-2表达降低。Feng等[15]研究发现，p53通过控制Bax/Bcl-2蛋白完成对细胞凋亡的调控，Bcl-2可抑制线粒体释放凋亡形成因子细胞色素C，具有抗凋亡作用，而Bax可促进细胞色素C的释放，具有促凋亡作用，p53可以通过下调Bcl-2，上调Bax的表达进而达到促凋亡的作用。本实验中，阿魏酸能够显著降低高糖诱导的p53和Bax表达水平，增加Bcl-2表达，从而降低高糖诱导的细胞凋亡。

Nagai等[11]研究报道，阿魏酸可以通过抑制机体氧化应激，降低淀粉样蛋白在HLEC中的聚集，从而达到抑制白内障患者晶状体混浊的作用。本实验结果显示，高糖促进HLEC 的p53、Bax表达和降低Bcl-2的表达，最终导致HLEC凋亡的增加。然而，此现象可被阿魏酸改善，也提示阿魏酸在降低高糖引起的HLEC凋亡过程中，很有可能是通过调控p53信号来发挥作用的。当然，这并不能排除阿魏酸其他的作用通路，后续我们将进一步探讨。

综上，高糖促进HLEC的凋亡，阿魏酸可能通过p53降低Bax表达和促进Bcl-2表达，减少HLEC的凋亡，减轻高糖对HLEC的损伤，从而达到防治DC的作用。