阿柏西普对碱烧伤大鼠角膜新生血管的抑制作用△

张慧 单伟

碱烧伤是眼科最常见和最具破坏性的眼科紧急情况之一，可导致角膜上皮缺损、角膜急性炎症、角膜新生血管 (corneal neovascularization，CNV)和角膜透明度降低[1]。CNV形成通常与眼表和角膜的炎性、感染性、创伤性、毒性、退行性或免疫性疾病相关[2-3]，并且由于水肿、瘢痕形成或脂质沉积，CNV可能导致严重的视力损害甚至失明[4]。在CNV生成的过程中，由多种刺激和抑制因子调节[5]，而在各种促血管生成因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族在刺激内皮细胞增殖和新生血管形成中起着至关重要的作用[6-7]。阿柏西普(Aflibercept)能够通过人的IgG Fc片段将VEGF受体-1的第二结构域和VEGF受体-2的第三结构域结合，并充当所有VEGF-A同种型的受体诱饵，与VEGF-A、VEGF-B和胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)结合从而增强抗血管生成反应，具有迄今为止研究的所有VEGF阻断剂的最高亲和力[8-9]。近年来，根据CNV的形成机制，越来越多的药物已经被研究出来，但阿柏西普与CNV生长及消退的关系国内报道尚少。本研究使用不同浓度阿柏西普滴眼液滴眼，通过免疫组织化学等不同方法观察碱烧伤后CNV生成及抑制情况，以揭示VEGF与CNV之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选用锦州医科大学实验动物中心健康成年SD大鼠36只，体质量为200～300 g，符合国家医用动物使用标准。用裂隙灯显微镜检查大鼠眼角膜正常。采用随机数字表法将大鼠分为4组，A组、B组、C组分别给予20 g·L-1、25 g·L-1、30 g·L-1的阿柏西普滴眼液滴眼，D组为生理盐水组(给予生理盐水滴眼)，每组各9只。

1.2 主要试剂与仪器裂隙灯显微镜数字图像处理系统(重庆，AT-16型)，眼科手术器械(显微剪刀、显微镊子，陕西达明生物科技有限公司)，VEGF试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，羊抗兔IgG、羊抗大鼠IgG(EMD Millipore公司，美国)，阿柏西普(上海，生工生物有限公司)，苏木精-伊红染色试剂(北京博奥森生物工程有限公司)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorption erperiment，ELISA)试剂盒(伊莱瑞特生物科技有限公司，武汉)。

1.3 角膜碱烧伤动物模型制备所有大鼠均建立角膜碱烧伤模型，碱烧伤前3 d，双眼滴3 g·L-1妥布霉素滴眼液，每天2次，裂隙灯检查双眼附属器和眼前段，排除眼部病变。通过肌肉注射50 mg·kg-1体质量氯胺酮盐酸盐和5 mg·kg-1甲苯噻嗪，并用4 g·L-1局部用盐酸苯氧乙酸盐诱导全身麻醉。将充分浸润1 mol·L-1NaOH溶液的圆形滤纸片，急性化学燃烧面积直径约为2 mm，置于干燥滤纸上1 s，蘸去多余碱溶液。在手术显微镜下，将滤纸片置于大鼠角膜中央烧灼40 s，所有碱烧伤操作均由一名研究人员进行，以尽量减少研究者之间的差异。烧灼后，用平衡盐溶液清洁角膜和穹隆，以去除残留的化学物质。角膜上皮混浊明显，基质层水肿，隐约可见虹膜即为造模成功。

1.4 干预方法各组大鼠均于造模当天开始滴眼。阿柏西普无菌条件下用生理盐水分别稀释成浓度为20 g·L-1、25 g·L-1、30 g·L-1的滴眼液，4 ℃冰箱保存，分别给予A组、B组、C组小鼠进行干预治疗；D组给予不含防腐剂的生理盐水溶液，每组每天2次滴眼，共14 d。

1.5 裂隙灯检查和CNV面积计算每组大鼠分别于碱烧伤后第3天、7天、14天腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪(11)混合液诱导麻醉，裂隙灯下观察大鼠角膜缘血管环充血、周边角膜和中央角膜水肿程度、角膜上皮愈合情况等，于角膜碱烧伤后第3天、7天、14天照相并测量CNV长度。测量时，以连续弯曲度最小，朝向角膜中心生长最长为准。CNV面积依据Robert电脑公式S=C/12×3.14×[r2-(r-l)2]计算(其中S为CNV面积，C为新生血管网的跨圆周钟点数，r为角膜半径，l为CNV长度)。观察是否存在前房出血、角膜溃疡及眼内炎，将发生严重前房出血、角膜溃疡穿孔及眼内炎者剔除。

1.6 HE染色与免疫组织化学检测造模后第14天，颈椎脱臼处死所有小鼠，取带1 mm宽巩膜的全角膜，将去核的眼睛固定在体积分数10%福尔马林溶液中进行组织病理学检查。固定后，解剖角膜。PBS冲洗除去福尔马林后，将所有标本包埋在石蜡中，冷却凝固。将石蜡块切成4～5 mm厚，切片用HE染色。加入CD34(150)、VEGF(1400)，4 ℃，加入羊抗大鼠IgG-FITC (1100)和羊抗兔IgG-Cy3(1200)。室温孵育20 min，PBS冲洗后，将标本置于载玻片上，透明树脂封片。

1.7 ELISA测定房水中TNF-α蛋白含量建模后第14天，将小鼠称质量后腹腔注射水合氯醛进行麻醉，无菌条件下抽取眼内房水，使用ELISA测定房水内TNF-α含量，其中标准品、空白孔和待测样品分别为标准品、样品稀释液和待测样品(10 μL房水+90 μL样品稀释液)。

1.8 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差表示，多组间数据比较采用完全随机设计资料和随机区组资料的方差分析，两组比较均采用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 裂隙灯显微镜下观察各组大鼠CNV大鼠角膜碱烧伤后第3天，A组、B组与C组中角巩膜缘血管扩张，未见明显的新生血管生长；D组角膜浅基质层轻中度混浊，可见新生血管出芽，由周边角膜缘向角膜中间蔓延，血管生长致密，相互交叉成网。碱烧伤后第7天，A组、B组与C组新生血管管径细小，多集中于角膜缘且生长缓慢；B组较A组与C组新生血管少；D组水肿明显，新生血管生长旺盛，血管显著变长、增粗，并在顶端出现分叉，虹膜上遍布呈刷状的血管。碱烧伤后第14天，A组、B组与C组血管床附近细小血管基本退化，分布局限且稀疏；B组新生血管的生长范围、数量及长度均较A组与C组轻；D组CNV呈垂柳状全部长入碱烧伤瘢，粗大致密，全角膜呈白色混浊。见图1。

图1 大鼠角膜碱烧伤后第14天各组CNV情况 A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

2.2 CNV面积碱烧伤后第3天、7天、14天对四组CNV面积进行计算，见图2。碱烧伤后第3天、7天、14天，A组、B组与C组的CNV面积均小于D组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；B组与C组各时间点CNV面积差异均无统计学意义(均为P>0.05)，但B组和C组与A组比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.3 HE染色结果碱烧伤后第14天，A组可见角膜基质层增厚，结构紊乱，新生血管管腔较密集，管腔内可见红细胞附着，炎性细胞浸润；B组可见角膜基质层结构整齐，少许新生血管管腔，角膜内少量炎性细胞浸润；C组角膜基质层结构较整齐，新生血管管腔稀疏，炎性细胞浸润；D组可见角膜上皮层变薄，基质层炎性细胞浸润，伴有大量毛细血管增生，可见成熟的新生血管，管腔内大量红细胞，见图3。

2.4 免疫组织化学检测CD34与VEGF蛋白的表达正常大鼠角膜无新生血管，CD34蛋白不表达，VEGF在上皮层角膜扁平上皮细胞、基底细胞呈弱阳性。角膜碱烧伤后第14天，各组角膜CD34和VEGF蛋白表达增强，与A组、B组、C组比较，D组CNV旺盛致密，CD34和VEGF蛋白表达较强(图4)，VEGF蛋白主要定位于角膜上皮细胞及基质新生血管内皮细胞胞浆，呈棕黄色颗粒分布；A组CNV较B组和C组多，CD34和VEGF蛋白表达增强；B组和C组棕黄色颗粒分布无明显差异。

图2 各组CNV面积统计图 与D组比较，*P<0.05；B组、C组与A组比较，#P<0.05

图3 碱烧伤后第14天，各组角膜组织HE染色(×200) A：A组；B：B组；C：C组；D：D组

图4 角膜碱烧伤后第14天，各组角膜CD34与VEGF蛋白表达(×200)

2.5 ELISA测定房水中TNF-α蛋白表达水平碱烧伤后第14天，ELISA测定A组、B组、C组、D组房水中TNF-α蛋白表达水平见图5。由图5可以看出，D组房水中TNF-α蛋白表达均高于A组、B组、C组房水中TNF-α蛋白表达，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；B组、C组房水中TNF-α蛋白表达与A组房水中TNF-α蛋白表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)；B组和C组房水中TNF-α蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 角膜碱烧伤后第14天，各组房水中TNF-α蛋白表达水平 与D组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05

3 讨论

角膜碱烧伤可导致破坏性并发症发生[10]。病理性CNV与感染或化学灼伤引起的炎症有关[11]。尽管血管生长可以修复其部分影响，但CNV和高通透性可能导致视力受损和移植失败[12]。有研究表明[4]，角膜损伤形成CNV后VEGF mRNA与蛋白表达水平升高，本研究中，角膜碱烧伤后第14天，免疫组织化学检测发现各组角膜VEGF蛋白表达增强，而与A组、B组和C组比较，D组VEGF蛋白阳性表达增强，这证明阿柏西普能够通过抑制VEGF的表达来抑制CNV。

血管内皮细胞具有CD34蛋白的特异性细胞表面标志物，其表达水平与新生血管的程度相关[13-14]。因此，本研究中使用CD34蛋白作为评估CNV的标记物。Jin等[15]报道，与对照组角膜染色比较，CD34烧灼的角膜中表达增加，并且在烧伤后第3天大鼠角膜中的CD34蛋白染色增加，并且在第10天达到峰值水平。本研究于角膜碱烧伤后第14天处死了所有动物，免疫组织化学检测结果显示，烧灼眼中的CD34蛋白表达水平增加，与Jin等[15]的结果相似，同时我们发现B组中CD34蛋白的表达量最低。此外，使用这些药剂新生血管不能完全恢复，可能是抗VEGF的单作用效应的原因，其仅抑制VEGF，但不产生其他细胞因子，如血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子。因此，我们认为，实验模型中大鼠的药物半衰期和对药物的反应可能与人类不同，并且泪膜对局部药物的快速清除可能导致药物在眼表面渗透较少。

TNF-α是参与炎症、免疫、细胞稳态和肿瘤进展的关键细胞因子[16]。本研究中，A组、B组、C组房水TNF-α蛋白含量明显低于D组，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，因此，我们推断阿柏西普可能通过降低眼内TNF-α蛋白水平抑制碱烧伤诱导的CNV。

Park等[17]提出局部使用阿柏西普可能对CNV有抑制作用。另外，早期的实验研究报道腹腔注射阿柏西普在治疗CNV中具有潜在贡献[18-20]。本研究中，我们使用了阿柏西普局部滴眼的方法，通过观察其发生发展情况及角膜内VEGF蛋白的表达情况，观察CNV与VEGF蛋白之间的时空一致性，结果证实阿柏西普可以减少碱烧伤引起的CNV，降低VEGF和CD34蛋白的表达及炎症因子水平，为临床防治碱烧伤引起的CNV治疗提供了新的思路。