氡对空气凤梨DNA 的辐射损伤效应

郑桂灵 李 鹏 周 峰

1（青岛农业大学资源与环境学院 青岛266109）

2（南京晓庄学院食品科学学院 南京211171）

氡是铀（238U）衰变链中镭（226Ra）的衰变产物，半衰期为3.82 d。由于226Ra 广泛存在于岩石、土壤等各种地质环境中，所以，氡（222Rn）广泛存在于大气中，是自然界含量最丰富的天然放射性气体［1］。氡气本身在人体内驻留时间短，不会对人体健康造成很大危害。但是，氡衰变子体的性质与氡的性质完全不同，它们是重金属固体微粒，很容易和空气中的颗粒物质结合而变成结合态氡子体。氡子体被人体吸入后，衰变时产生的α粒子在体内照射，使得身体受害组织或细胞（主要是肺器官）发生电离化，破坏脱氧核糖核酸（DNA）的分子结构，影响细胞的再生过程，并引起细胞染色体的畸变，由此引发癌病变［2］。国际癌症研究机构（IARC）已将氡及其子体归为I 类致癌因素，世界卫生组织（WHO）也把氡作为19种人类致癌因子之一［3］。氡及其子体对于动物体的损伤已有很多研究。吸入氡子体后，大鼠上皮细胞的周期停滞，合成DNA 的细胞数明显减少［4］。Nie等［5］通过氡染毒大鼠尿液、外周淋巴细胞以及肺，结果发现，氡可以增加大鼠的氧化损伤，并抑制DNA修复酶8-羟基鸟嘌呤DNA 糖苷酶和8-羟基脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷酶表达下降。Joster等［6］利用25.4 GBq 的流动氡气体照射源照射中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamsters ovary，CHO），在52 个氡诱发突变中，48%为基因丢失，23%为基因重组或失去1 个或几个外显子。之后的研究进一步表明，氡及其子体衰变产生的α粒子会造成一系列遗传上的改变，包括DNA 双链断裂、基因漂变、微核产生以及与之相关的蛋白表达等［7-11］。

氡对植物体是否像对动物体一样造成损伤尚罕有报道［12-13］。Villalobos-Pietrini等［14］通过实验表明，将Tradescantia花序经不同浓度的氡气处理后，在花粉母细胞减数分裂的四分体期观察到了微核的产生。我们的实验表明：松萝空凤（Tillandsiausneoides，T.usneoides）和贝可利空凤（Tillandsiabrachycaulos，T.brachycaulos）接受72 h的氡气薰蒸后遭受到了一定的生理损伤，如松萝空凤电导率值上升、贝可利空凤丙二醛（MDA）含量明显增加等；同时具有一定的抗性，如超氧化物歧化酶（SOD）含量在两种植物中均显著增加［15-16］。放射性物质对生物的伤害主要在于各种射线通过电离和激发对DNA 分子发生作用，使细胞受到损伤，从而导致各种危害［17］，而氡气及其子体对植物DNA分子会产生什么影响一直未见报道。

我们继续以空气凤梨中的两种生态类型，即单株生长的贝可利空凤和丛生的松萝空凤做为实验材料，通过标准氡室对其进行不同氡浓度熏蒸处理后检测植物体的DNA 变化，以图阐明氡是否可对植物体产生显著影响，植物体受氡污染后哪些指标可反映这一影响的程度，并探讨了叶表鳞片在这一过程中所发生的作用，为研究氡与植物体的辐照损伤提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 氡室设置

在北京大学的标准氡室中进行植物的氡气薰蒸处理。氡室由主腔室、氡源（226Ra）、测量系统（RAD7测氡仪，美国DURRIDGE公司）和其他配套设备组成；其容积约为1 m3，设有连接氡源（226Ra）的一条充氡气路，以及连接测氡仪的一条测量气路。氡室内配有小型风扇使腔室内氡浓度均匀。

1.2 植物氡气薰蒸

对单株生长的贝可利空凤，选取生长健康、大小相似的40株，将其随机分为4组。其中1组做为对照，置于正常室内环境中（氡平均浓度约为20 Bq/m3）；1组人工去除其叶表鳞片后接受氡气的熏蒸，初始氡浓度为2 560 Bq/m3；另2组不去除叶表鳞片，直接接受氡气的熏蒸，初始氡浓度分别为2 879 Bq/m3和4 525 Bq/m3。

对于丛生的松萝空凤，称取3丛生长健康的松萝，每丛200 g，将其分为对照组和2 个实验组。对照组置于正常室内环境中，实验组初始暴露浓度分别为2530 Bq/m3和3 910 Bq/m3。

为减少植物的自身生长状态对实验结果的影响，实验前将植株浸泡于去离子水中20 min，使其吸水饱和，后在相同条件下统一晾30 min，以细线均匀悬挂于氡室中固定位置（图1）。封闭氡室后调节氡室起始氡浓度，对植物持续熏蒸72 h 后测其遗传指标。

图1 氡室中的空气凤梨:(a)贝可利空凤；(b)松萝空凤Fig.1 Tillandsia plants in the radon chamber:(a)T.brachycaulos;(b)T.usneoides

1.3 彗星实验

采用单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis，SCGE），又称彗星实验（Comet assay）来检测氡气熏蒸后的植物DNA 损伤情况。由于该方法具有敏感、简便、快速、低耗、重复性好等独特优点，并可直接观察单个细胞内的DNA 损伤，从Ostling 等［18］采用SCGE 技术检测DNA 的双链断裂开始，该方法迅速成为近年常用的DNA损伤检测方法。

1.3.1 植物细胞核的提取

植物样品用双蒸水冲洗后剪碎，加入2%纤维素酶和果胶酶混合液，混匀后于4 ℃静置2 h，梯度离心收获，镜下观察细胞核形态完整，磷酸缓冲盐溶液（PBS）重复洗涤细胞2次，将细胞悬于PBS，调整细胞浓度至2×104mL−1，置于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 碱性单细胞凝胶电泳实验

（1）铺胶：0.75%正常熔点琼脂糖凝胶煮沸后取100 μL迅速均匀铺于自制微电泳槽内，置于4 ℃冰箱1 min 使凝胶固化，取制好的细胞悬液25 μL 与75 μL 0.75%低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第一层凝胶上面，置于4 ℃冰箱固化1 min。（2）裂解：将微电泳槽置于新鲜配制的碱性裂解液中，于4 ℃冰箱中裂解2 h。（3）裂解后取出微电泳槽，用双蒸水漂洗去掉多余的盐分，置于提前加入4 ℃碱性电泳液的水平电泳仪中静置20 min，然后在20 V，200 mA 电泳条件下电泳20 min。（4）染色和观察：2 μg/mL溴化乙锭（EB）染色，双蒸水漂洗，去掉多余染液，先在荧光显微镜（Axioskop 2 mot plus，Carl Zeiss，德国）低倍镜下观察彗星，然后在高倍镜下，用图像采集系统随机抓取彗星图像，每份样品拍摄200个彗星细胞。

1.4 数据分析

每个彗星图像均采用波兰大学提供的CASP系统自动分析，测定彗星拖尾长度（Tail length）、彗星尾部DNA 相对含量（Tail DNA）、尾动量（TM）和Olive 尾动量（OTM）。对不同氡浓度处理后所测的遗传指标间的差异，采用SPSS 20.0 软件对数据进行单因素方差分析，p＜0.05 视为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 氡对贝可利空凤叶片DNA 的辐射损伤

不同浓度氡处理后，贝可利空凤叶片细胞核电泳后获得彗星图像如图2 所示。由图2 可以看出，随着氡浓度增加，彗星尾部逐渐增长，表明DNA 迁移量增加。且尾部DNA 的含量随之增加。当氡浓度增加到4 525 Bq/m3时，从彗星图像上看仍然有明显的头部，但是DNA 迁移量明显增加（图2（d））。

以CASP 统计后，得到DNA 损伤程度的各种参数见表1。由表1 可以看出，与对照相比，被3种浓度的氡处理后，头部DNA 相对含量显著减少（p＜0.05）。这一趋势在表征DNA 损伤程度的其他5个参数中更为明显，随着氡浓度增加，彗星长度、尾长、尾部DNA 相对含量、TM和OTM均显著增加（p＜0.05），而且存在一定的剂量−效应关系，说明氡引起了贝可利空凤的DNA 损伤。

对去除叶表鳞片的植株而言（表1），虽然所施加的最初氡浓度较低（2 560 Bq/m3），但从彗星图像上可以看出，与对照相比，彗星尾部明显增长，DNA 迁移量明显增加（图2（c））。其DNA损伤指标值（表1）与不去除鳞片植物经高浓度（4 525 Bq/m3）氡处理后相近（p＞0.05），远大于不去除鳞片植物经低浓度（2 879 Bq/m3）氡处理后的指标（p＜0.05）。这说明没有叶表鳞片时，植株DNA 辐射损伤程度更高，而叶表鳞片的存在对氡的辐射起到了一定的防护作用。

图2 贝可利空凤叶片经氡处理后的彗星图像：(a)对照；(b)植物未去除鳞片，氡初始浓度为2 879 Bq∙m−3；(c)植物去除鳞片，氡初始浓度为2 560 Bq∙m−3；(d)植物未去除鳞片，氡初始浓度为4 525 Bq∙m−3Fig.2 Comet images for DNA damages in leaves of T.brachycaulos induced by radon:(a)control;(b)plants with foliar trichomes exposed to radon at initial concentration of 2 879 Bq∙m−3;(c)plants without foliar trichomes exposed to radon at initial concentration of 2 560 Bq∙m−3;(d)plants with foliar trichomes exposed to radon at initial concentration of 4 525 Bq∙m−3

表1 贝可利空凤经氡处理后的SCGE分析Table 1 SCGE analysis of T.brachycaulos exposed to radon

2.2 氡对松萝空凤叶片DNA 的辐射损伤

经过不同浓度氡处理后，松萝空凤叶片DNA损伤状况与贝可利空凤类似。随着氡浓度增加，彗星尾部逐渐增长，表明DNA 迁移量逐渐增加（图3）。以CASP 统计表明，头部DNA相对含量明显减少，尾部DNA相对含量明显增加，彗星长度、尾长、TM 和OTM 的值也随之显著增加（p＜0.05），这说明氡也引起了松萝空凤DNA 损伤并存在一定的剂量−效应关系（表2）。

图3 松萝空凤经氡处理后的彗星图像：(a)对照；(b)氡初始浓度为2 530 Bq∙m−3；(c)氡初始浓度为3 910 Bq∙m−3Fig.3 Comet images for DNA damages in T.usneoides induced by radon:(a)control;(b)treated at initial concentration of 2 530 Bq∙m−3of radon;(c)treated at initial concentration of 3 910 Bq∙m−3of radon

表2 松萝空凤经氡处理后的DNA损伤Table 2 DNA damage of T.usneoides exposed to radon

3 讨论

我们之前的研究已表明，空气凤梨可通过表面吸附、叶片吸收等作用有效吸收氡室中的氡，意味着氡可对植物进行体外辐照或内部辐照［19］。彗星实验所展示出来的DNA 指标（表1、2）表明，贝可利空凤和松萝空凤叶片DNA 确实不可避免地遭受了辐射损伤。在动物中，SCGE技术早已表明，随着大鼠暴露氡及其子体剂量的增加，外周血淋巴细胞、单个核细胞、肺细胞、支气管肺泡灌洗液细胞的DNA 迁移长度均逐渐增大，且有一定的剂量−效应关系［8-10］。植物在遭受辐照后也会产生类似情况，Saghirzadeh等［20］通过彗星实验发现高浓度的226Ra 对Alliumcepa的根细胞有巨大的影响。浓度1 000 μmol/L 的铀会导致Phaseolus根 细 胞DNA 几 乎 完 全 断 裂、 弥 散［21］。 当Tradescantia花粉母细胞经氡处理后，在其细胞分裂的四分体阶段出现了明显的微核现象［14］。因此，当空气凤梨叶片经氡处理后，其尾部DNA、尾长、TM 和OTM 的值随着氡浓度的增大而增加，且有明显的剂量−效应关系。这些指标也可以作为反映氡对植物损伤的敏感指标。

贝可利空凤去除鳞片实验也表明，空气凤梨对氡具有一定的抗性，而叶表鳞片在其中起着重要作用。因为在相近浓度氡胁迫下，人工去除鳞片的贝可利空凤DNA 损伤程度远远大于不去除鳞片的植株（表1）。实际上，做为常用的积累型指示植物，一个基本条件是必须具备的，即对污染物具有较强的抗性，不会受污染后很快致死。空气凤梨可以做为积累型指示植物的类群，已被广泛应用于Hg、Cu、Fe、Ni、Mn、Pb、V、Cs、Sr、Zn、PCB（多氯联苯）、PAH（多环芳烃）等多种大气重金属、核素和有机污染物的监测，其对各种污染物的较强抗性广为人知［22-26］。空气凤梨叶片表面覆盖有厚厚的鳞片，利用SEM 技术对松萝空凤吸收Hg、Pb、Cs、Sr 等重金属粒子的研究表明，绝大部分重金属颗粒被叶表鳞片所吸附［27］。也就是说，鳞片做为叶片最外层的保护结构，能有效防止污染物进入植物体内对植物产生伤害。虽然氡是一种辐射性气体，但其对生物体的影响除气态的222Rn 外，主要是其各种粒子态的子体，如钋218（218Po）、铅210（210Pb）、铋210（210Bi）、钋210（210Po）等，它们均主要以类似重金属的形式存在。因此，空气凤梨对氡也具有一定的抗性是不难理解的。

另外，即使有少量氡能进入植物内部，抗氧化酶系统的存在也能进一步减轻氡对植物的伤害。抗氧化酶是植物活性氧自由基清除剂，当植物受到逆境胁迫时，这些保护酶的活性会增强，从而可以有效清除体内的自由基，使膜系统减轻因自由基而引发的过氧化作用伤害，保持膜结构及功能的稳定［28-29］。之前的实验已表明，贝可利空凤和松萝空凤的SOD活性随着氡浓度的增加显著升高，说明在氡胁迫下，松萝体内活性氧清除体系开始发挥作用，这在一定程度上能减轻氡对植物的伤害，增强空气凤梨对氡的抗性［15-16］。