复方树莓籽粉对小鼠放射性脊髓损伤的防护作用

2020-03-03鲁召翔王金辉逄翔宇夏玉军

辐射研究与辐射工艺学报 2020年1期

鲁召翔王金辉徐宁栾桀逄翔宇夏玉军

1（青岛大学医学部青岛266071）

2（青岛大学医学部人体解剖与组织胚胎学教研室青岛266071）

近年来，随着医学的进步，放射性诊疗的应用越来越普遍［1］，如CT、PET/CT、γ 刀、介入治疗、放射性核素治疗等技术越来越多地应用到临床上。这也使得医生和患者接触放射性射线的概率大大提高［2］，特别是肿瘤的放射治疗，会产生严重的并发症，严重影响着肿瘤患者的预后和生存质量［3］。放射性脊髓损伤是放疗过程中一种罕见而严重的并发症，多见于头颈部、上消化道、脊柱旁或脊髓等各种恶性肿瘤的放疗后［4］，发生率约为0.85%～3.51%［5］。目前，临床上有效方法不多，药物治疗主要有类固醇、鸦片拮抗剂（纳络酮），晚期则以康复治疗为主［6］，因此早期预防极为重要。近些年，寻找有效的辐射防护剂成为研究热点，但是能够预防脊髓放射性损伤的药物鲜有报道。复方树莓籽粉的有效成分为原花青素、维生素C、维生素E 及微量元素等，具有抗氧化，减轻细胞损伤，延缓细胞凋亡等作用［7］。在小鼠的急性放射性脊髓损伤中也具有一定的防护作用［8］。本实验将观察复方树莓籽粉作为辐射防护剂对小鼠放射性脊髓损伤的防护作用，为抗辐射药物的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及器材

复方树莓籽粉（山东黑尚莓生物技术发展股份有限公司）；尼氏染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；中性树胶（北京索莱宝科技有限公司）；柠檬酸钠抗原修复液（北京索莱宝科技有限公司）；兔抗小鼠Fas多克隆抗体（美国Proteintech公司）；兔抗小鼠caspase-9 多克隆抗体（美国Proteintech 公司）；山羊抗兔IgG 抗体（美国Abcam公司）；DAB试剂盒（北京中杉金桥公司）。

电热恒温水箱（HH.W21.420，北京科伟永兴仪器有限公司）；电热恒温培养箱（DNP-9162，上海三发科学仪器有限公司）；石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）；奥林巴斯显微镜；佳能EOS 600D相机。

1.2 动物分组

健康成年雄性昆明小鼠50 只，体质量（20±2） g，购自济南鹏悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK 鲁2014-0007。随机分为空白组、模型组、复方树莓籽粉低浓度组、复方树莓籽粉中浓度组、复方树莓籽粉高浓度组，每组10只。以正常成人推荐量设置高浓度组，中浓度组、低浓度组分别为二分之一和四分之一推荐剂量。小鼠分笼后，于明暗12 h 交替、自由饮水进食、湿度适宜、温度（25±2）℃的环境中饲养。

1.3 动物处理及辐射损伤模型的建立

通过灌胃的方式分别对低、中、高浓度组进行给药，每组的剂量分别为37.5 mg/kg 体重、75 mg/kg 体重和150 mg/kg 体重。将复方树莓籽粉溶解于1 mL 蒸馏水中，每只每天给药一次，模型组给予1 mL 蒸馏水灌胃，空白对照组不做处理。第15 天，除空白对照组外，其余各组小鼠在灌胃后，即刻进行一次性全身X 射线辐照。将小鼠放入边长为20 cm，高度4 cm的盘盒内，放置在医用放疗机辐射台（山东大学齐鲁医院肿瘤科提供）上接受一次性全身辐照，辐射源距离小鼠100 cm，辐射视野80 cm×80 cm，吸收剂量率4 Gy/min，辐照时间1 min，总剂量为4 Gy，建立小鼠放射性脊髓损伤模型。照射结束之后继续给药直至实验结束。

1.4 苏木精-伊红和尼氏染色

辐照后第3 天处死小鼠，取出脊髓于4%多聚甲醛中固定。经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，用切片机切成5 μm 和10 μm 的薄片，分别进行苏木精-伊红（HE）染色和尼氏染色，光学显微镜下观察其形态学变化。

1.5 免疫组化(SABC)染色

取材固定包埋同HE染色，切片机切成3 μm的薄片，采用SABC法，二氨基联苯胺显色。以胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性反应，光镜下做定性观察。在400 倍镜头下，每个样本随机选取5个视野拍照，用Image Pro Plus 6.0软件计算平均光密度进行半定量分析［9］。

1.6 数据统计

使用SPSS 软件对所得数据进行统计学分析，数据以xˉ±s表示。组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，p＜0.05时差异显著，p＜0.01时差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 HE染色结果

HE 染色结果显示，空白组小鼠脊髓结构完整，灰质内神经元细胞形态正常，间质内血管壁结构完整清晰；模型组可见神经元细胞胞体缩小变形，核深染，核仁消失，严重者细胞核可溶解消失，少见卫星现象，偶见噬神经现象，还可见毛细血管扩张充血，并伴有炎细胞浸润；低浓度组、中浓度组和高浓度组中，灰质损伤明显减轻，且随复方树莓籽粉浓度增加，损伤程度逐渐降低（图1）。

图1 脊髓灰质HE染色，×400Fig.1 HE staining of spinal cord gray matter,×400

空白组白质内神经纤维排列紧密有序，结缔组织致密；模型组白质中神经纤维肿胀，结缔组织疏松，原有组织结构被破坏，并伴有炎细胞浸润；低浓度组、中浓度组、高浓度组组织结构破坏程度较模型组减轻，神经纤维肿胀减轻，结缔组织较致密，炎细胞浸润减少。相比低浓度组，高浓度组损伤程度减轻（图2）。

2.1.2 尼氏染色结果

尼氏染色结果显示，空白组神经元细胞饱满，尼氏体数量较多，均匀分布于胞体中，胞体呈斑驳的蓝紫色染色。模型组细胞内尼氏体明显减少，染色程度变浅。相比模型组，低浓度组、中浓度组、高浓度组中神经元细胞染色逐渐加深，尼氏小体数量逐渐增多，见图3。

图2 脊髓白质HE染色，×400Fig.2 HE staining of spinal cord white matter,×400

图3 脊髓尼氏染色，×400Fig.3 Nissl staining of spinal cord,×400

2.1.3 免疫组化染色结果

免疫组化结果显示，空白组中偶见阳性细胞，模型组中可见Fas、Caspase-9 呈强阳性。Fas 阳性细胞在灰质中均匀分布，在白质中极少出现。Caspase-9 阳性细胞主要分布在脊髓前角，白质中也有出现，低浓度、中浓度、高浓度组较模型组染色程度随浓度的增加而降低（图4、图5）。

平均光密度计算结果如表1所示。

图4 脊髓免疫组化染色（Fas），×400Fig.4 Immunohistochemistry(IHC)of spinal cord(Fas),×400

图5 脊髓免疫组化染色（Caspase-9），×400Fig.5 IHC of spinal cord(Caspase-9),×400

表1 免疫组化平均光密度Table 1 Average optical density of IHC

2.2 讨论

放射性脊髓损伤是放射治疗中不可逆的严重并发症，目前对于此种损伤并没有统一有效的解决方案。放疗射线会使机体产生活性氧，其在放射性细胞损伤中扮演重要的角色：破坏细胞膜结构、蛋白质等，导致脂质过氧化、蛋白质变性，引起细胞损伤［4，10-11］，还可攻击细胞DNA，诱导细胞凋亡［12］。

有研究表明，放射性脊髓损伤主要有3 种机制［13］：（1）射线辐照直接导致脊髓损伤；（2）射线辐照损伤脊髓内动脉血管，引起缺血性改变，致使脊髓缺血性坏死，损伤静脉血管导致局部毛细血管充血、出血、坏死等，引起继发性改变；（3）机体产生免疫反应。放射性脊髓损伤的组织学改变主要有4种：（1）出血型，脊髓内小血管充血出血；（2）坏死型，主要见于白质，个别神经细胞也可见；（3）萎缩型，主要见于实质细胞，神经细胞可见固缩或缺血性改变；（4）空泡型，白质可见空泡样改变。据杨永利等［14］报道，在急性脊髓损伤后，脊髓继发性损伤对组织的损伤要大于原发急性损伤，而细胞凋亡则是继发性脊髓损伤中导致细胞损伤的重要原因。据此猜测，在脊髓受到射线辐照之后，也会出现细胞凋亡等继发性脊髓损伤。细胞凋亡主要有外在和内在两条通路［15］，两条通路最终都是通过激活Caspases 来使细胞凋亡［16-18］。Caspases是一个酶家族，通过级联反应最终导致细胞凋亡，对细胞凋亡起着关键作用［19-21］。其中，外在通路是有死亡受体介导，Fas 是主要的死亡受体之一。在外界信号刺激下，Fas 与Fas-L 结合经过一系列反应，与Caspase-8 前体结合，组成诱导死亡信号复合体，在经过一系列信号转导，激活Caspase-3，引起细胞凋亡［22-24］。内在途径也被称为线粒体途径，外界的凋亡刺激因子与凋亡蛋白酶激活因子-1 形成多聚复合物，然后与胞浆中的Caspase-9 前体结合，引起Caspase-9 前体活化，活化后的Caspase-9 再激活下游的Caspase-3，通过级联反应，诱导细胞凋亡［25］。

本实验中，HE 染色结果显示模型组神经元细胞胞体固缩，严重者细胞核可溶解消失，少见卫星现象，偶见噬神经现象，还可见毛细血管扩张充血；白质中神经纤维肿胀，结缔组织疏松，原有组织结构被破坏。尼氏染色结果显示模型组中尼氏体大量减少，与文献［13］报道基本一致。复方树莓籽粉溶液处理组损伤较模型组明显减轻，且浓度越高，效果越明显。复方树莓籽粉中的有效成分有维生素C、维生素E，具有强抗氧化能力，这可能是其具有抗组织损伤作用的原因。免疫组化结果显示，模型组Fas、Caspase-9表达量较空白组均明显升高，表明射线辐照启动了细胞凋亡通路。低浓度组、中浓度组、高浓度组表达量较模型组均有所下降。通过计算平均光密度可见浓度越高表达量越少。推测复方树莓籽粉能够抑制Fas、Caspase-9 的过表达，从而抑制细胞凋亡，但其抑制过表达的具体机制还有待进一步研究。