不同浓度二甲亚砜深低温保存实验犬血小板相关参数变化研究*

李丽玮 于建 李兴龙 钟宁 严赛 杨燕 严钱勤 丁在咸 李志强

随着兽医学和实验动物学的发展，犬类长期受人类驯化，生长环境和人类较为相近，加上其体型合适，已成为多种疾病的实验动物模型广泛用于生命医学研究[1-4]。使用实验动物模型进行相关研究时，经常会出现因血小板数量或/和功能减少导致的出血，为了延长实验动物模型观察期往往需要输注血小板。由于受到诸多因素限制，实验犬间即刻输注新鲜血小板有时很难实现，能否在紧急情况下输注深低温保存血小板从而延长实验犬生存期、以及实验犬血小板深低温保存前后相关参数的变化等研究国内外报道甚少。因此，为了明确实验犬血小板深低温保存前后变化，笔者选择比格犬作为实验动物对象，进行不同浓度二甲亚砜实验犬血小板深低温保存前后相关参数变化研究，旨在为实验犬安全、及时和有效的输血提供实验依据。

资料与方法

1 动物来源 雄性比格犬购自上海交通大学农学院实验实习场，SCXK（沪）2017-0007，皆由上海市第六人民医院动物房提供饲养（SPF级，质量合格证号：NO.201705569），实验动物饲养设施合格证号：SYXK（沪）2016-0020。

2 主要试剂耗材与设备

2.1 试剂：血细胞分析用稀释液（CELLPACK）（济南希森美康医用电子有限公司，批号：G7164），血细胞分析用溶血剂（STROMATOLYSER-4DL）（希森美康生物科技（无锡）有限公司，批号：R7030），血细胞分析用溶血剂（SULFOLYSER）（SYSMEX CORPORATION，批号：A6001），血细胞分析用染色液（STROMATOLYSER-4DS）（SYSMEX CORPORATION，批号：A7032），清洗液（CELLCLEAN）（SYSMEX CORPORATION，批号：A7001）。血小板糖蛋白-Ib、血小板选择素、血小板因子-4、β-血小板球蛋白检测试剂（上海笃玛生物科技有限公司，批号依次为：180725C、180815B、180810A、180813B）等。

2.2 耗材：一次性使用塑料血袋（上海输血技术有限公司，注册证编号：国械注准20153661020，生产许可证号：沪食药监械生产许20000466号），含输血用1号抗凝液28mL。

2.3 设备：Sysmex自动血液分析仪（日本Sysmex株式会社制造，型号：XE21OO）；酶标仪（瑞士帝肯公司，Infinite F50型）、离心机（湖南湘仪股份有限公司，TG16-W型）等。

3 实验方法

3.1 血液采集：比格犬16只，应用戊巴比妥钠麻醉后各放血400 mL至血袋中，每袋200 mL。

3.2 制备冰冻血小板：利用无菌导管连接器将血袋与200 mL转移袋相连接。将200 mL血袋在（4±2）℃、2500 g离心12 min后，分离出血小板悬液。在无菌条件下，将盛有血小板悬浮液袋置于水平振荡振荡仪上轻轻晃动（60-80次/min），同时按2%或5%二甲基亚枫（DMSO）比例使用无菌注射器缓慢注入（1 mL/min）盛有血小板悬浮液袋中，使DMSO与血小板悬液充分混匀后分装成5袋并标记，将盛有血小板悬浮液袋厚度控制在3-5 cm，平置放于-80℃低温储血冰箱内冻存备用。

3.3 制备冰冻解冻去甘油红细胞：将冰冻血小板从-80℃低温储血冰箱中取出，立即水平置于42℃水浴中使其快速融化至液体状态后取出。

3.4 检测项目与方法：在冰冻前、冰冻第1天（1 d）、冰冻第35天（35 d）、冰冻第60天（60 d）、冰冻第90天（90 d）、冰冻第180天（180 d）分别进行血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）、血小板分布宽度（PDW）、血小板糖蛋白-Ib（GP-Ib）、血小板选择素（P-Selectin）、血小板因子-4（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）相关检测。实验步骤严格按照各检测项目操作规程实施。

4 统计学处理 应用SPSS20.0软件，计量资料以均数±标准差（ ±s） 表示，组内数据比较采用配对t检验，组间数据比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 血小板常规参数变化 2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻前PLT、PCT分别与冰冻后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；而2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻前MPV、PDW分别与冰冻后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的PLT分别相互间比较差异也均无统计学意义（P＞0.05）。2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻后1d的MPV、PDW、PCT分别与冰冻后35 d、60 d、90 d、180 d比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻后35 d、60 d、90 d、180 d的MPV、PDW、PCT分别相互比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。2%二甲亚砜组1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的PLT、PCV、MPV、PDW分别与5%二甲亚砜组冰冻后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2 血小板生化参数变化 2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻前GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分别与冰冻后1 d比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；而分别与冰冻后35 d、60 d、90 d、180 d比较均有统计学差异（P＜0.05）。2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻后1 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分别与冰冻后35 d、60 d、90 d、180 d比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；冰冻后35 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分别与冰冻后60 d、90 d、180 d比较差异均有意义（P＜0.05）。2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻后60 d GP-Ⅰb、PF4分别与冰冻后90 d、180 d比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；而冰冻后60 d的P-Selectin、β-TG分别与冰冻后90 d、180 d比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。2%二甲亚砜组和5%二甲亚砜组冰冻后90 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分别与冰冻后180 d比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。2%二甲亚砜组1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TGP分别与5%二甲亚砜组冰冻后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 不同浓度二甲亚砜深低温保存实验犬血小板常规参数变化

表2 不同浓度二甲亚砜深低温保存实验犬血小板生化参数变化

讨 论

为了最大限度提高实验犬的生存率[5]，及时给实验犬输血是一种重要的治疗手段。然而，犬间输血的血源十分匮乏[6-7]，尤其是对血小板数量减少或/和功能低下伴有严重出血倾向的实验犬，是否可像人类一样在紧急情况时输注血小板，从而延长其生存期的国内外报道甚少。目前国内对血小板数量减少或/和功能低下伴有严重出血倾向患者，通常输注保存期5天血小板。然而，诸多原因导致我国血小板供需矛盾十分突出。因此，部分严重出血患者在无保存期5天血小板前提下，也接受5%二甲亚砜制备冰冻血小板紧急输注，起到了一定的止血效果，挽救了患者的生命[8-12]。

涉及血小板相关功能与因子参数主要包括：血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）、血小板分布宽度（PDW）、血小板糖蛋白-Ib（GP-Ib）、血小板选择素（P-Selectin）、血小板因子-4（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）等。其中GP-Ib是胶原、凝血酶、血管性假性血友病因子、纤维蛋白原和二磷酸腺苷等受体的成分，参与血小板黏附、聚集和活化反应，是生理性止血和病理性血栓形成的重要部分。P-Selectin主要分布于血小板α颗粒及内皮细胞的棒状（Weibel-Palade）小体；当血小板及内皮细胞受到凝血酶、组胺、补体、氧自由基等刺激后迅速与质膜融合而在血小板和内皮细胞表面表达，启动了血小板与内皮细胞间以及相关细胞与白细胞的相互黏附，也参与血栓形成的病理过程。PF4是由血小板α颗粒合成的一种特异蛋白质，是一种碱性多肽的四聚体；易结合并中和肝素，也易结合于血管内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素上，以减慢凝血酶灭活过程，从而促进血栓形成。β-TG是一种血小板特异性球蛋白，在诱导剂刺激下由血小板α颗粒释放至血浆中，可反映血小板特异的释放功能。因此，为了进一步明确深低温保存对实验犬血小板的影响必须进行相关功能参数研究，为实验犬安全、及时和有效输血提供实验依据。

二甲亚砜（DMSO）是一种重要的渗透型细胞保护剂，能够降低细胞冰点，在深低温（-200℃）保存细胞时，能快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成和细胞结构紊乱，避免细胞损伤的发生。因此，DMSO是目前最常用的细胞冻存保护剂。然而，DMSO也存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水基团发生作用可导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。6%DMSO于-80℃进行血小板冰冻保存，可使其保质期由7天延长至2年[13]，而该浓度下冷冻后的犬血小板活性有所降低[14]。另外，有研究结果表明，5%DMSO于-80℃进行血小板冰冻保存后，会导致血小板微粒表面受体表型发生变化，改变其中肌动蛋白、细丝蛋白、原肌球蛋白的表达[15]。因此，本研究在应用常规5%DMSO进行血小板冰冻保存研究，同时尝试使用低浓度DMSO（2%）进行犬血小板冰冻保存研究，其目的在于为了尽量避免实验犬在输注冰冻血小板后，由于残留DMSO导致临床动物试验各种结果的不确定性。

本研究结果表明应用2%二甲亚砜浓度和5%二甲亚砜浓度分别深低温保存血小板，其保存前后PLT、PCT、GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG变化均不明显（P＞0.05）；而MPV、PDW则有不同程度变化（P＜0.05）。随着深低温保存血小板时间的延长，在1-180d内除PLT外MPV、PCT、PDW、GP-Ib、P-Selectin、PF4、β-TG分别均有不同程度增高。笔者认为在180天内应用2%和5%二甲亚砜浓度对实验犬血小板进行深低温保存，随着保存时间的延长，血小板相关因子促凝活性没有明显减弱趋势。另外，2%二甲亚砜浓度进行深低温保存血小板的PLT、MPV、PCT、PDW、GP-Ib、P-Selectin、PF4、β-TG分别与5%二甲亚砜浓度进行深低温保存血小板比较无明显区别（P＞0.05）。因此，笔者认为为了减少残留DMSO量导致临床动物试验各种结果影响，在遇到实验犬因血小板因素引起的出血可推荐应用2%二甲亚砜浓度深低温保存血小板。