原发免疫性血小板减少症患者PBMC中CD200/CD200R1表达及临床意义*

臧艳 叶辛 钱宝华

原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）是临床上最常见的出血性疾病之一，其病理特点是患者产生针对自身血小板的抗体，导致血小板破坏增多及生成障碍。常见的临床表现为皮肤瘀点瘀斑，严重者可出现难以控制的内脏和头颅出血，严重危害患者的生命健康[1]。与大部分自身免疫性疾病相似，自身免疫稳态的失衡是导致疾病的关键因素，其中众多的免疫细胞均参与该过程，如自反应性T细胞、调节性T细胞、B细胞及单核细胞等[2]。目前多数研究认为T细胞功能紊乱在ITP的发病中起到决定性作用[3]，具体来说就是Th17亚型细胞的过多激活[4]，导致患者自身免疫亢进。

CD200是一种Ⅰ型膜糖蛋白，广泛表达于多种细胞与组织中，通过与其结构相似的受体CD200R1来传递影响多种生理系统的应答信号。与CD200不同，其受体CD200R1的表达更局限于髓系和淋巴系的细胞中[5]。已经有许多研究显示，CD200参与了多种疾病的发病机制，包括肿瘤、过敏性疾病及自身免疫性疾病。研究表明，CD200/CD200R1信号在类风湿关节炎（RA）患者滑膜及外周血中存在表达量及功能的异常，参与了RA疾病的免疫调节及病理转归[6]。在另一种常见的自身免疫性疾病系统性红斑狼疮（SLE）患者中也发现了CD200和CD200R1的信号异常，并参与了SLE疾病的免疫紊乱[7]。然而人们对于该信号通路分子是否在ITP疾病患者中表达异常以及是否与ITP的自身免疫紊乱有关仍不清楚。

基于上述研究进展，本研究拟探讨ITP患者外周血PBMC中CD200及其受体CD200R1的表达情况，分析其与ITP患者Th1/17细胞亢进的关系，为深入理解ITP的发病机制提供新的实验依据，并为可能的免疫调节治疗方法提供潜在靶点。

材料与方法

1 研究对象 本研究共纳入2014年9月～2016年5月上海长海医院新诊断的ITP患者共19例，其中男性7例，女性12例，平均年龄51.2岁。所有患者均符合中华医学会血液学分会关于ITP诊断达成的专家共识[8]。

与此同时，同期纳入了与ITP患者组年龄、性别差异无统计学意义的19名健康体检者为健康对照组。该研究通过上海长海医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署了书面知情同意书。

2 试剂与仪器 人淋巴细胞分离液（Sigma，P7794），TRIzol（Invitrogen，15596018），PrimeScript RT Master Kit（Takara，RR036A），TNF-α，IFN-γ及IL-17 ELISA试剂盒（R&D DTA00D，DIF50，D1700），Sysmex XT-2100L全自动血液分析仪，实时荧光定量PCR仪（ABI 7500）。

3 方法

3.1 临床标本收集：用枸橼酸钠抗凝采血管收集ITP患者组和健康对照组外周血各10 mL。

3.2 实时荧光定量PCR法检测PBMC中CD200/CD200R1的表达量：首先采用Ficoll密度梯度离心法分离每个标本的PBMC，利用TRIzol法提取样本总RNA，按照试剂盒说明书反转录制备cDNA备用。采用SYBR Green嵌入染料法进行PCR扩增反应。以β-actin作为内参基因，采用2-△△Ct方法计算CD200及CD200R1在ITP组和健康对照组中的相对表达量。

3.3 采用ELISA法检测TNF-α，IFN-γ及IL-17的蛋白浓度：离心后取得血浆标本，按照试剂盒说明书步骤检测TNF-α，IFN-γ及IL-17在血浆中的蛋白浓度。

4 统计学处理 应用GraphPad Prism软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差的方式表达，两组间的均数比较采用成组t检验或配对t检验，利用Spearman秩相关法进行相关性分析。检验水准设置为α=0.05，所有分析均为双侧检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 ITP患者PBMC中CD200及CD200R1表达量下调如图1所示，与健康对照组相比，ITP患者PBMC中CD200及CD200R1的mRNA表达量均下调，差异有统计学意义（t=36，P＜0.05；t=38，P＜0.05）。

2 ITP患者血浆中TNF-α，IFN-γ及IL-17蛋白表达量上调 如图2所示，与健康对照组相比，TNF-α，IFN-γ及IL-17蛋白表达量在ITP患者组中均上调，差异有统计学意义（t=33.11，P＜0.05；t=14.92，P＜0.05；t=37.16，P＜0.05）。

表1 CD200/CD200R1与ITP患者血小板计数的相关性分析

表2 CD200/CD200R1与TNF-α及IL-17表达量的相关性分析

3 ITP患者中CD200和CD200R1与血小板计数、TNF-α、IFN-γ及IL-17蛋白表达量的相关性分析如表1所示，CD200和CD200R1均与患者血小板计数间呈正相关。另如表2所示，ITP患者中CD200和CD200R1分别与TNF-α及IL-17的表达量间呈负相关。

4 监测经有效治疗后ITP患者外周血PBMC中CD200/CD200R1的表达水平 共有11例患者经地塞米松治疗后，达到临床完全缓解的标准。进一步采集了这11例患者完全缓解后的外周血PBMC标本。经实时荧光定量PCR检测后发现，CD200/CD200R1的表达量较治疗前均上调，差异有统计学意义（t=8.53，P＜0.000 1；t=7.225，P＜0.000 1）（图3）。

讨 论

目前，临床上治疗ITP的手段十分有限，大部分药物治疗只能做到缓解症状，难以根治[9]。其根本原因是疾病发病机制未完全阐明。虽然其病理表现仅为血小板减少导致患者出血风险增加，但其背后的机理十分复杂，涉及了复杂的免疫信号网络调控，以及遗传和环境的影响[10]。因此，深入研究ITP患者体内免疫稳态失衡的具体机制具有重要的科学和临床价值。

本研究首次发现CD200/CD200R1信号分子在ITP患者PBMC中表达异常，且与ITP患者的血小板计数的相关性有统计学意义。目前评价ITP患者临床症状严重程度的指标十分有限，血小板计数是一个较直观的指标。患者血小板计数越低时，直接反映血小板破坏过多及生成减少的状态，而患者的凝血功能亦越低，出血症状及风险越重[11]。本研究中发现CD200/CD200R1与患者的血小板计数正相关，说明CD200/CD200R1信号分子与ITP的疾病严重程度相关，未来可作为监控ITP病情的潜在指标。

已有研究表明，T细胞免疫失调是ITP发病的关键因素，患者通常呈现Th1/17型细胞因子表达亢进，从而打破自身免疫耐受，产生自身抗体，导致疾病。CD200/CD200R1分子可以抑制免疫系统的反应，维持外周的免疫耐受。有研究表明CD200-/-的RA疾病模型小鼠的病理进程显著加速[12]。上调CD200的表达后RA疾病进展被延缓或完全停止。这一作用是通过影响细胞因子的生成实现的，其可以减低促炎性细胞因子的表达水平，如TNF-α、IL-1β、MMP-13及IFN-γ[13]。本研究发现，CD200/CD200R1信号分子与TNF-α及IL-17的表达水平呈负相关，说明ITP患者中低表达的CD200/CD200R1可以使促炎性细胞因子TNF-α及IL-17的表达水平升高，加重患者的病理状态。该结果与之前研究发现的ITP患者Th1/17亢进是相符的。

综上所述，CD200/CD200R1的表达及功能在ITP患者的发病机制中发挥重要作用，其可能通过减少炎性因子分子的表达发挥抑制作用，调控患者的疾病进程。本研究结果为未来评估ITP患者疾病状态及靶向性免疫治疗提供了新的潜在靶点和实验依据。