色素万寿菊试管苗玻璃化控制的研究

吴丽芳 田雪莲 魏晓梅 路小春 钱绍方 桂宝林

摘  要：以色素萬寿菊带腋芽的茎段为外植体，研究离体快繁中蔗糖、AgNO₃、琼脂、植物凝胶、活性炭及不同封口材料对芽增殖及玻璃苗产生的影响。结果显示：30 g/L蔗糖适合万寿菊幼苗的生长，玻璃化率随蔗糖浓度（10～60 g/L）的增加而减少，60 g/L的蔗糖玻璃化率仅9.13%;AgNO₃有抑制玻璃苗发生作用，5.0 g/L AgNO₃可使玻璃化率低至9.81%;活性炭的用量对玻璃化影响最为明显，5.0 g/L活性炭可使玻璃化率高达38.18%;琼脂和植物凝胶对芽的增殖及玻璃化发生表现相同的趋势，低浓度时有利于芽的增殖，高浓度可有效防止玻璃化发生，10 g/L的琼脂玻璃化率低至8.31%;2.0 g/L的植物凝胶芽增殖系数高达3.35，5.0 g/L植物凝胶玻璃化率低至6.67%;棉花塞+双层牛皮纸+棉线封口时，芽增殖系数高达3.24，玻璃化率低至8.46%。

关键词：色素万寿菊;试管苗;玻璃化;增殖中图分类号：Q949.783.5      文献标识码：A

Vitrificationof Regenerated Shoots of Tagetes erecta L.in Pigment Marigold

WU Lifang¹， TIAN Xuelian¹， WEI Xiaomei¹， LU Xiaochun¹， QIAN Shaofang²， GUI Baolin³

1. College of Biological Resource and Food Engineering， Qujing Normal University / Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing， Yunnan 655011， China; 2. Qujing BoHao Biotech Co.， Ltd.， Zhanyi， Yunnan 655331， China; 3. Soil Fertilizer Workstation， Xundian Agricultural Bureau， Xundian， Yunnan 650224， China

Abstract： The stem with axillary buds fromTagetes erecta L. was used as the explants， and the effects of sucrose， AgNO₃， agar， plant gel， activated carbon and different sealing materials on shoot proliferation and vitrification were studied in this paper. The results showed that 30 g/L sucrose was suitable for the growth of the plantlet. The vitrification rate decreased with sucrose concentration increased （10-60 g/L）. The vitrification rate was only 9.13% with sucrose concentration at 60 g/L. AgNO₃had the effect of inhibiting the growth of glass seedlings. 5.0 g/L AgNO₃ had a vitrification rate as low as 9.81%. The quantity of activated carbon （AC） was most obvious to vitrification， 5.0 g/L AC was most serious for vitrification， and the vitrification rate was as high as 38.18%. Agar and plant gels showed a same trend for bud proliferation and vitrification. Low concentration was conducive for shoot proliferation and high concentration could effectively prevent the occurrence of vitrification. Vitrification rate was the lowest， only 8.31% for 10 g/L agar. The shoot proliferation coefficient was as high as 3.35 for 2.0 g/L plant gel， and the vitrification rate was as low as 6.67% for 5.0 g/L plant gel. When cotton plug plus double kraft paper plus cotton thread was used as the sealing materials， the shoot proliferation coefficient was as high as 3.24 and the vitrification rate was as low as 8.46%.

Keywords：pigment marigold; regenerated shoots; vitrification; proliferation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.016

万寿菊（Tagetes erecta L.）属菊科万寿菊属一年生植物，原产于墨西哥，早在1700年我国华南就有记载。色素万寿菊花瓣是提取植物性源叶黄素最理想的原材料之一，被作为经济作物大量栽种，其经济价值远高于多数常规经济作物^[1]。我国是世界上色素万寿菊原材料主要栽培国，其种植面积占世界总种植面积的1/3左右，但仍满足不了市场的需求。国内天然叶黄素精油市场需求量每年约10万t以上，而实际产量不足6 kt，随着市场发展，这种天然叶黄素的需求将会越来越大，开发潜能也必会十分广阔。我国在万寿菊育种研究方面稍显滞后，提取叶黄素的专用植物资源及品种匮乏;目前虽对完全依赖进口种子的局面有所改善，但仍缺乏自主知识产权品种，可用品种来源单一，多数还是常规品种种子，其色素含量比较有限，多在16‰左右，而杂交品种色素含量高达19‰～22‰，色素含量每增加1个千分点，价格将提高500元以上，因此培育色素万寿菊杂交种对于万寿菊产业具有重要意义^[2]。万寿菊杂交育种过程中，种质资源狭窄，母本资源中雄性不育系来源有限，短期内满足不了育种的大量需求，组织培养技术可在短期内快速扩繁出大量育种材料，可为万寿菊新品种选育提供资源基础。但色素万寿菊组织培养中，存在着难以克服的难题——玻璃化现象。

试管苗玻璃化是指组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈全透明或半透明状等外观形态异常的现象。形态上玻璃花苗水水渍化、株形矮小腫胀，节间短或几乎没有，叶表面缩小或增大，叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易破碎，细胞中含水量高，叶绿素、蛋白质、纤维素、木质素等含量低，生理生化代谢紊乱，分化能力低，增殖困难，移栽后难以成活^[3-5]，常影响组培苗的质量及规模化生产。自Debergh等^[6]对组织培养系统研究中提出“玻璃化”一词以来，人们对玻璃化发生的原因^[7]、玻璃苗的解剖特征^[8]、生理特性^[9]等都做了一些研究工作，但对玻璃化发生机理的研究并没有得出可定结论。玻璃化试管苗CAT（catalase）、SOD（superoxide dismutase）、 POD（peroxidase）活性比正常试管苗高^[10]，马婧等^[11]等对老山芹正常试管苗与玻璃苗的对比分析得出，玻璃化苗淀粉含量、可溶性蛋白、总叶绿素含量和干物质积累率降低，而可溶性糖含量比正常苗高。张琳等^[12]研究认为，大蒜试管苗玻璃化是ROS产生所致，且进一步研究认为质外体是最先感受外源H₂O₂胁迫的细胞器^[13]。导致玻璃化苗发生的因素非常多，不同植物或是同一植物不同器官、组织其主导影响因素也各有差异，至今尚未找到一个普遍适用的控制措施和行之有效的解决方法，因此仍需对玻璃化现象进行更系统和深入的研究。基于此，本研究利用前期试验筛选的培养基，通过比较蔗糖、封口材料、固化剂、抗氧化剂和吸附剂及添加物AgNO₃对玻璃苗产生的影响进行研究，以期找到万寿菊组织培养过程中玻璃化防止措施，为建立色素万寿菊高效再生体系提供依据。

1  材料与方法

1.1 材料

试验材料取自云南曲靖博浩生物科技股份有限公司大棚内育苗30～45 d万寿菊母本资源B_1-1植株带腋芽的茎段。

1.2 方法

1.2.1  外植体表面消毒  将取来的材料自来水下冲洗20 min，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1% HgCl₂消毒10 min，无菌水冲洗4～6次后吸干备用。试验使用的琼脂（500 g/瓶，强度1200 g/cm²）和植物凝胶（100 g/瓶，植物细胞培养级）均为上海源叶生物科技有限公司产品，均为分析纯。

1.2.2 试管苗培养  将带腋芽茎段接种于MS+ 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂（pH 5.8）培养基上进行培养，每瓶接种3～4个茎段，20 mmol/（m²·s）光下培养，光照16 h/d，温度（25±1）℃。培养30 d后，获得的试管苗用于后续试验。

1.2.3  试验设计及处理  试验设置6组不同处理：（1）对照（CK）：以MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L琼脂（pH 5.8）为基本培养基进行培养。（2）蔗糖处理组：在MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA +7 g/L琼脂（pH 5.8）培养基中分别加入蔗糖10、20、40、50、60 g/L;（3）AgNO₃处理组：分别在基本培养基中添加AgNO₃0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L;（4）活性炭（AC）处理组：分别在基本培养基中添加AC 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L;（5）固化剂处理组：分别在基本培养基中添加琼脂6.0、8.0、9.0、10.0 g/L，植物凝胶2.0、3.0、4.0、5.0 g/L;（6）封口材料处理组：用罐头瓶塑料盖、封口膜+橡皮筋、棉花塞+双层牛皮纸+棉线作为封口材料。试验中其余处理均用封口膜+棉线为封口材料，每处理3次重复，每重复10瓶，每瓶接种试管苗3～5株。培养条件同1.2.1。芽增殖系数和玻璃化苗率计算公式如下：

活性炭对克服试管苗玻璃化有明显的效果，毛俊红^[21]在对牡丹研究中，添加6 g/L活性炭和3 g/L PVP可显著抑制牡丹玻璃苗。饶雪琴等^[22]添加0.3%的活性炭，可使番木瓜玻璃化率明显降低。李娜等^[23]在色素万寿菊的研究中得出，活性炭含量在0～0.1%时，能够明显降低玻璃化程度，而从0.1%增加到0.5%时，玻璃化程度明显增高。本研究中，与对照相比，1.0 mg/L活性炭使玻璃化率降低了，而高于1.0 mg/L的活性炭增加了万寿菊的玻璃化，5.0 g/L 活性炭产生的玻璃化现象最为严重，玻璃化率高达38.18%。组织培养中，活性炭使用有利也有弊，一方面可以吸附有毒有害物质，但同时吸附作用无选择性，使用量不当时，吸附了培养基中铁盐和维生素等与玻璃化密切相关的物质从而增加玻璃化率。

固化剂琼脂和植物凝胶通过影响培养体系的衬质势而影响组培苗的玻璃化。固化剂浓度太低，培养基凝固性不好，水分过多，易导致玻璃化发生，浓度过高，培养基过硬，培养基内水分少，培养物难以吸收营养也影响组培苗的生长。本研究认为7.0 g/L的琼脂芽增殖系数最高，为2.88，10 g/L的琼脂玻璃化率最低，仅8.31%;2.0 g/L的植物凝胶芽增殖系数高达3.35，5.0 g/L植物凝胶玻璃化率低至6.67%。从经济角度及培养效果考虑，植物凝胶价格比琼脂要高，使用琼脂成本会更低。

封口材料影响培养瓶内的湿度和通气状况，透气性好的封口材料既能防治细菌和真菌孢子进入培养瓶内，又能达到瓶内外空气交换的目的，可降低玻璃苗形成几率。高疆生等^[24]采用棉塞有效地降低了香石竹玻璃化。本文对塑料盖、封口膜+橡皮筋、棉花塞+双层牛皮纸+棉线进行对比研究，得出棉花塞+双层牛皮纸+棉线封口可使万寿菊芽增殖系数高达3.24，玻璃化率低至8.46%。

综上所述，蔗糖浓度对色素万寿菊试管苗增殖及玻璃化有一定影响，30～40 g/L蔗糖适宜万寿菊试管苗生长、增殖，60 g/L是降低色素万寿菊试管苗玻璃化的适宜浓度。5.0 g/L AgNO₃可有效将万寿菊试管苗玻璃化率降低至9.81%;高浓度的琼脂和植物凝胶均可降低万寿菊试管苗玻璃化率，但从成本考虑，使用琼脂更经济。活性炭的浓度对不同植物材料有很大差异，色素万寿菊中不宜使用过高浓度的活性炭，建议浓度在0～ 1.0 g/L。

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