环状RNA生物特性与非小细胞型肺癌的研究进展

姜艳茹 李伟 陈余清

蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科233000

通信作者：陈余清,Email:bbmccyq.@126.com

肺癌在全球和中国的癌症相关死亡中位居首位。据估计,到2019年,肺癌死亡人数为142,670人,占癌症相关死亡人数的24%[1],其中非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的83%。尽管近几年,NSCLC在诊断及治疗 (包括手术、放疗和化疗)方面取得了较大的进展,但大部分肺癌患者确诊时已是晚期,总体5年生存率仅为21%[2],因此对于NCSLC 患者来说提高早期诊断效率和探索新的治疗靶点非常重要。

随着RNA 测序技术的发展,发现环状RNA (circular RNA,circRNA)在多种生物体内异常表达,其产生机制、结构特性及生物功能被学者们广泛研究。目前,有学者提出circRNA 表达异常对改变肿瘤生物学特性具有较大的影响[3],使circRNA 成为当下研究的热点。本文综述了国内外相关报道,旨在阐明circRNA 的特征、生物功能及与NSCLC的关系,为进一步寻找NSCLC 新的生物标志物、诊断和治疗的方法提供理论基础。

1 circRNA的结构与特性概述

1.1 circRNA 的生物结构与类型 随着生物技术及信息学的快速发展,大量的circRNA 被发现广泛存在于哺乳动物体内[4]。最初,由于其低丰度、结构特异性、功能未知等特点,circRNA 被认为是前m RNA (pre-m RNA)在剪接过程中的错误剪切或无功能的转录副产物[5]。但是进入21世纪后,研究者们发现circRNA 参与多种疾病 (如肿瘤、风湿系统疾病、心血管系统疾病、神经系统疾病等)的发生、发展过程。不同于线性RNA 的直接生成,circRNA 是通过非序列的pre-m RNA 反向剪切、连接成一个共价闭合环路结构[6]。

根据其起源,circRNA 主要分为以下4 类：外显子circRNA、外显子内含子circRNA、内含子circRNA 和来源于转运RNA 的内含子circRNA[7]。其中外显子circRNA起源于外显子类型,占circRNA 的80%以上,环化形成机制主要包括以下3 种[8]： (1)套索驱动环化模型。pre-m RNA中不相邻的外显子相互靠近,形成由外显子和内含子组成的套索中间体,其中内含子被剪切,外显子的下游5'端剪接位点 (剪接供体)和上游3'端剪接位点 (剪接受体)相互链接形成外显子circRNA;在某些特殊情况下,套索中间体中的内含子并不完全被剪切,被外显子包围保留下来,产生外显子内含子circRNA[7]。 (2)内含子配对驱动环化模型。通过内含子侧翼互补序列或反向重复序列的碱基对直接配对完成内含子配对驱动环化[7]。 (3)RNA 结合蛋白 (RNA binding protein,RBP)交联配对驱动环化模型。该模型由2个侧翼相互靠近的内含子反向互补序列引导形成 (如Alu 元素)[9]。此模型的形成需要RBP参与 (如MBL、QKI、hnRNP、丝氨酸/精氨酸蛋白等),可以结合线性pre-mRNA 序列上侧向内含子的特定序列,将2个侧向内含子连接在一起,进而促进成环和随后的circRNA 生成;相反有些RBP阻碍circRNA 的形成,如腺苷脱氨酶通过直接结合和弱化RNA 双键 (如反向Alu重复),减少腺苷转肌苷过程,抑制circRNA 的形成,高表达腺苷脱氨酶破坏内含子碱基互补配对过程,减少premRNA 环化,降低circRNA 形成的可能性[10];同时有些RBP对circRNA 的生物发生既有正调控又有负调控作用(如FUS、hnRNPL)[11-12]。

内含子circRNA 是外显子和内含子形成的套索中间体,摆脱了正常的去内含子分支及降解过程,遵循标准的pre-m RNA 剪接、修饰而形成的。来源于转运RNA 的内含子circRNA 生物形成与tRNA-剪接核酸内切酶复合体相关,该复合体是由一种特定的内切酶和连接酶组成,它通过识别外显子-内含子连接处序列切割位点进行切割,从而产生转运RNA 的内含子circRNA[7]。

1.2 circRNA 的基本生物特性 由于circRNA 的生成机制与线性RNA 不同,因此其具有独特的生物特性。 (1)丰富性：目前大量研究表明,在真核生物中有超过10万个不同的circRNA[7];(2)稳定性：circRNA 是闭合环状结构,没有5'-7甲基鸟嘌呤的帽结构和3'-腺苷酸尾结构不易被核酸外切酶降解[13],可在唾液、血液及外泌体中稳定存在;(3)保守性：circRNA 在不同种族间具有高度保守性[14];(4)特异性：circRNA 在不同组织和不同发展阶段的表达不同,具有细胞特异源性和组织特异源性[15]。这些特性可能使得circRNA 成为癌症患者诊断、预后和治疗反应的有效的生物标志物[16]。

2 circRNA的生物功能

2.1 circRNA 通过 “海绵”miRNA 调控基因的表达 circRNA 通过竞争性内源RNA 机制吸附miRNA,直接调节靶基因活性。竞争性内源RNA 包含miRNA 反应原件的转录物,通过竞争积极调节其他具有相同miRNA 反应原件的RNA 转录物,在m RNA 和ncRNA 之间形成了功能性的相互作用[7]。miRNA 是一类小ncRNA,它与靶向m RNA 的3'未翻译区域互补位点结合,在转录后水平上调节m RNA 的表达,由此形成circRNA-miRNA-m RNA 轴,影响靶基因的转录后过程[17]。CDR1 as/ciRS-7是第1个被发现具有miRNA 海绵作用的circRNA,包含70 多个与miR-7结合的位点,可以显著抑制miR-7 的活性,调节靶基因的活性,参与包括肺癌在内多种疾病的发生、发展[18]。

2.2 circRNA 参与调节基因的转录和剪接过程 circRNA通过募集表观遗传调制器或转录因子来调控基因的表达。少数circRNA (circEIF3J、circPAIP2 等)定位于细胞核内,与RNA 聚合酶Ⅱ结合,作为miRNA 诱饵,通过UI Sn RNA/U1A/U1C复合物与5'端位点的内含子相互作用提高 转 录 效 率[19]。ci-ankrd52 是 来 源 于ankrd52 基 因 的circRNA,在ankrd52基因转录起始区大量富集,特异性结合亲本基因ankrd52 主动转录的RNA 聚合酶Ⅱ,增强了ankrd52的转录效率,当ci-ankrd52敲除后,转录效率明显降低,表明ci-ankrd52促进亲本基因的转录[20]。

circRNA 与RBPs结合形成复合体,直接调节基因的转录及转录后水平。在人宫颈癌细胞中发现有大量circRNAs 与 HuR 蛋 白 结 合, 其 中 最 显 著 的 是circPABPN1;实验发现,过表达circPABPN1使得Hu R 靶向的数种mRNA 表达量降低,最为显著的是PABPN1 mRNA,进一步研究发现circPABPN1 与mPABPN1 竞争性结合 HuR,抑制mPABPN1 的翻译从而发挥调控作用[21]。

此外,有研究表明circRNA 表达水平与某些基因剪接效率呈负相关性,其生物形成与pre-m RNA 剪接产生竞争关系,使mRNA 表达水平降低,表明在线性转录组和环状转录组之间存在剪接机制竞争[21-22]。

2.3 circRNA 直接翻译成多肽或蛋白质 研究表明,某些circRNA 可以直接翻译成多肽或者蛋白质。不同于m RNA翻译需要5'-7甲基鸟嘌呤的帽结构和3'-腺苷酸尾结构的参与,circRNA 上含有直接与核糖体结合的内部核糖体进入位点序列和特定的起始密码子ATG,当真核细胞核糖体40S和circRNA 结合,circRNA 作为模板起翻译作用,并且人体细胞中circRNA 的翻译是通过滚动循环放大过程实现,不需要传统的翻译所需元素[23]。Yang等[23]发现,在人体细胞中N6-甲基化驱动的circRNA 转译普遍存在;Zhang等[24]发现一种含有内部核糖体进入位点驱动的开放阅读框序列circRNA (circ-SHPRH),直接编码蛋白质SHPRH-146aa,并且两者在胶质母细胞瘤中的表达均是减少的,机制上泛素化的SHPRH 序列使增殖细胞核抗原成为E3连接酶,而SHPRH-146aa使全长SHPRH 不被泛素蛋白酶体降解,抑制细胞增殖和致瘤性。

3 circRNA与NSCLC的相关研究

3.1 circRNA 与NSCLC 发生、发展的关系 circ-ITCH是首先被报道的在肺癌组织中异常表达的circRNA,它通过结合miR-7和miR-214上调ITCH 的表达,降低Wnt/β蛋白通路的活性,抑制肺癌细胞的增殖[25]。目前被广泛研究的circRNA-CDR1as(又称ciRS-7),它包含了超过70个与miRNA 结合的位点,Yan等[26]发现CDR1as在NSCLC患者癌组织较癌旁组织中表达上调,与患者TNM 分期、总体生存期、临床病理参数相关,并且发现CDR1as的表达水平是NSCLC患者预后的独立因素。机制上CDR1as作为 “海绵”吸附miR-7,上调miR-7 的靶基因EGFR、CCNE1和PKI3CD 的表达,促进肺肿瘤的生长与增殖。

Chen等[27]对正常支气管上皮细胞系 (16 HBE)和恶性转化细胞系 (16HBE-t)行circ RNA 芯片分析,结果发现与16HBE 比较,16HBE-t中circRNA100146 的表达最为显著,并且在NSCLC 组织和细胞系中行逆转录实时定量PCR 进一步验证,其表达水平在组织及细胞中均升高。通过绘制受试者工作特征曲线,结果示circRNA100146具有诊断NSCLC 潜在的能力。相关体内外实验表明,减少circRNA100146表达降低了癌细胞的增殖和侵袭能力、促进癌细胞凋亡,并且可与多种剪接因子家族SF3、miR-361-3p 和 miR-615-5p 结合,直接影响下游多种包括NFAT5、COL1A1、TRAF3 和MEF2C 在内的m RNA 的表达,促进肺癌的发生、发展。

在Wei等[28]研究中发现circPTPRA 较癌旁组织和支气管上皮细胞株在NSCLC组织和细胞株中表达显著降低,其表达水平与淋巴结转移密切相关,总体生存期较高表达组更短;在H23和H1755细胞株中敲除circPTPRA,E-钙粘蛋白表达水平降低、N-钙粘素和波形蛋白表达水平升高,增强了肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,并且实验表明circPTPRA 是通过结合miR-96-5p调节上皮间质细胞的转化,上调下游肿瘤抑制因子RASSF8,进而促进肿瘤的发生、发展。

基于circRNA 特殊的生物结构,使得其能够稳定的存在于人的唾液、血液及外泌体中[16];Hang等[29]在NSCLC患者血浆中发现circFARSA 表达显著上调,对50 例NSCLC 患者和健康正常人血浆中circ FARSA 和FARSA m RNA 行逆转录实时定量PCR 验证,发现在NSCLC 患者血浆中circFARSA 高表达,而FARSA m RNA 几乎测不到;受试者工作特征曲线下面积为0.71,表明血浆中的circFARSA 可作为诊断NSCLC 潜在生物标志物;体外构建过表达circFARSA 载体,发现可增强细胞转移和侵袭能力,生物信息学分析提示circ FARSA 可能与miR-330-5p、miR-326、miR-1178-3p、miR-620和miR-1270相结合,可能参与多种癌症相关途径,其中miR-330-5p和miR-326可能直接与脂肪酸合成酶相互作用,脂肪酸合成酶作为一种致癌基因出现在各种肿瘤中,从而促进肺癌的发生、发展。

3.2 circRNA 在NSCLC 预后与诊疗方面的应用 circ_0003645在NSCLC 组织和细胞系中表达上调,表达水平与TNM 分期密切相关。通过海绵miR-1179 调控TMEM/4A 的表达,相当于原癌基因的作用促进癌细胞生长与转移且抑制癌细胞凋亡,并且高表达组比低表达组患者总体生存率低,表明circ_0003645是NSCLC 患者的独立预后因素[30]。由此可见,circ_0003645不仅参与了NSCLC的发生、发展,而且可以作为预测NSCLC 患者预后的良好指标。

在Liu等[31]的实验中发现,hsa_circ_0005962在肺腺癌细胞系和肺腺癌患者血浆中表达均增高,其受试者工作特征曲线下面积为0.73,表明hsa_circ_0005962可作为诊断肺腺癌的生物标志物;对术前和术后肺腺癌患者血浆中hsa_circ_0005962表达量进行测定,发现术后肺腺癌患者血浆中hsa_circ_0005962的表达量明显低于术前,若沉默其表达可能对治疗肺腺癌具有重要意义。circPRKCI是来源于染色体3q26.2扩增,在肺腺癌组织中高表达,通过结合miR-545和miR-589,消除了转录因子E2F7对肿瘤的抑制作用,促进肿瘤的发生、发展[31-32];在异种移植模型中肿瘤内注射以circPRKCI为靶点的siRNA,抑制了肿瘤的生长、增殖,这为肺腺癌分子靶向治疗提供理论基础。

circ_0016760在NSCLC 组织和细胞系中表达显著上调,结合miR-1287 调节GAGE1 的表达,促进癌细胞增殖、转移、侵袭,抑制癌细胞凋亡,过表达miR-1287或沉默GAGE1可部分抑制circ_0016760表达引起的细胞增殖、侵袭能力[33]。动物实验发现,沉默circ_0016760表达组小鼠体内肿瘤体积较小。综上表明,circ_0016760/miR-1287/GAGE_1调节信号参与肺癌的发生、发展,可作为NSCLC治疗的理想靶点。

Qu等[32]发现hsa_circ_0020123在临床NSCLC 患者组织中显著高表达,通过生存曲线分析发现高表达hsa_circ_0020123组的患者总体生存时间缩短,表明其可作为判断NSCLC预后的潜在生物标志物;进一步将A549细胞株中hsa_circ_0020123的表达沉默,其增殖、侵袭和转移能力明显减弱, 凋亡能力增强, 将沉默hsa_circ_0020123表达的A549细胞注入小鼠皮下,发现小鼠体内的肿块重量较对照组明显减少;机制上hsa_circ_0020123通过结合miR-144 上调ZEB1 和ZEH2的表达促进肿瘤的发生、发展,这对判断NSCLC 患者预后和后续治疗提供了新的靶点及理论基础。

4 总结和展望

细胞内存在大量的circRNA,广泛参与了体内绝大多数重要的生物学过程,它独特的多层次调控为探明许多复杂疾病的发病机制提供了新思路。目前,研究者们发现大量circRNA 在NSCLC 中异常表达可能参与NSCLC 的发生、发展,并且可作为NSCLC 诊断和判断预后的潜在生物标志物,为治疗提供新的理想靶点。但是,目前大部分研究者仅仅是通过生物信息学的方法预测circRNA 可能在NSCLC中发挥的作用,并且绝大多数的circRNA 是作为竞争性内源RNA 在被研究,竞争性内源RNA 内源性竞争机制极其复杂,其调控网络需纳入更多的因子 (如m RNA、蛋白等)来丰富和完善,进一步深入研究circRNA 在NSCLC发病机制和调控途径中的作用,有助于为肺癌的诊断和精准治疗开辟新的途径。总体来说,circRNA 在NSCLC中研究前景是可期待的。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突