microRNA特异性表达对肺癌的诊断及预后的临床意义

张东伟 蓝冰 钟家将

柳州市人民医院呼吸与危重症医学科545000

通信作者：蓝冰,Email:277191282@qq.com

肺癌是一种对人生命健康威胁最大的肺癌,其病死率和发病率逐年升高[1]。近年来研究发现,全球肺癌发病率高于其他肺癌,男性肺癌病死率和发病率高居肺癌第一位,女性高居第二位[2]。截至目前,肺癌的发病原因仍未十分明晰,但大量研究表明,肺癌的发生与吸烟密切相关,研究人员提出,长期大量吸烟人群肺癌患病率是不吸烟人群的20倍[3]。目前临床上缺乏有效的肺癌诊断和筛查生物学标志物,所以大量患者一旦确诊即为肺癌晚期。研究人员曾利用痰细胞学以及影像学来诊断肺癌,但是患者5年生存率依旧低于14%[4]。microRNA 是一种单链RNA 分子,其主要由人体内源基因编码,长度约为20～24个核苷酸。microRNA 在人体细胞内发挥着重要的调节作用,可以对靶m RNA 进行特异性识别,同时调控编码基因的表达;可以抑制基因转录和促进mRNA 降解,从而影响mRNA 水平。近年来研究发现,microRNA 能够调节人体细胞分化、代谢、增殖、耐药和死亡等生物学过程,microRNA 的异常表达与肿瘤的发生、诊断及预后有密切的关系[5]。可以通过比较人体癌变组织和正常组织microRNA 表达情况,对癌症的发生进行预测、诊断,通过调节部分具有致癌或者抑癌的特异性microRNA 可以达到治疗的目的,这与患者预后也有重要关系,为肺癌的诊断、治疗和预后提供了新的思路。

1 肺癌与microRNA作用机制

1.1 肺癌患者microRNA 的产生和作用原理 人体可编码m RNA 的DNA 主要存在于蛋白质编码基因的内含子和非编码区2个位置。位于非编码区的DNA 被人体内的RNA聚合酶转录为长度1～3 kb的前体,另外位置的DNA 转录生成的前体是通过剪切形成的。形成的前体经过2种特定的核糖核酸酶处理,形成100 nt左右的前体。此时的前体在输出蛋白5 的作用下侵入到人体胞浆,在特定的RNA酶作用下形成成熟的双联microRNA。micro RNA 诱导沉默复合体的主要部分是AGO 蛋白,AGO 蛋白可以和人体mRNA 非编码区发生作用,从而达到抑制蛋白质合成的作用。这种抑制作用主要通过2 种途径实现：一种是促进m RNA 的降解和脱腺苷化,另一种是在翻译的开始阶段发挥抑制作用[6]。正常情况下,双链micro RNA 中只有引导链能够进入microRNA 诱导沉默复合体,另一条链则被降解。相关研究发现[7],双链microRNA 中的过客链在脊椎动物进化过程中比较保守,在某些情况下还具有调节活性。通常情况下,microRNA 发挥作用的主要位置是胞浆,同时细胞核中检测出成熟microRNA,但是其作用机制仍不明晰。

能与microRNA 结合的靶基因序列为处于5'端的核酸“种子”序列,一般这样的种子序列有6～8 个,与这种“种子”序列互补的区域存在于mRNA 任意位置,大多数情况下位于3'区[8]。大量研究表明,micro RNA 可以与mRNA 其他区域进行结合。同时,microRNA 与mRNA 结合后,micro RNA 则会发挥其抑制作用或者迫使m RNA 降解,达到调控的目的[9]。之所以microRNA 能够调控多种基因,是因为microRNA 能够同时与多种mRNA 结合。反之,一种基因也可以同时受到众多microRNA 的调控。

最近研究发现,microRNA 还有众多非常规作用机制[10]。部分研究人员提出,microRNA 可以通过调节核糖体生物合成或者直接跳过细胞停滞周期来发挥调节作用。同时还发现,通过使m RNA 结合具有抑制酶翻译的抑制性蛋白或者蛋白复合体,microRNA 可以通过不同形式调节m RNA 水平[11-12]。1.2 microRNA 进入肺癌患者内循环机制 研究发现,人类血清和血浆中均发现 microRNA 存在,同时这些microRNA 即便在室温条件下长时间存放仍可以保持其稳定性。近年来研究证实,前列腺癌患者血清中microRNA-141较正常人稳定表达,其区分正常人和前列腺癌患者的特异度为100%,敏感度为62%[13]。同时研究证实,microRNA 可以在人体血液样本中稳定存在,学者们利用特定技术发现糖尿病、大肠癌、肺癌患者血清中存在特异性microRNA,这充分证明患者血清中存在肿瘤特异性microRNA 标志物[14]。

因为循环中microRNA 具有显著的特点：可以反复冻融、承受极端p H、耐受外源性RNA 等,人工合成的microRNA 注入人体内则会被迅速溶解,所以microRNA不会来源于死亡的肿瘤细胞作为裸露的RNA 释放。研究发现,循环体系中的microRNA 通常是被装进凋亡小体、微泡、外泌体等载体中,也有部分存在于高密度脂蛋白复合体或者蛋白质中。截至目前,多数研究人员认为人体血浆中microRNA 具有较强稳定性,由于在循环体系中,microRNA 主要是以膜包被的囊泡释放的[15]。部分研究人员使用过滤层析法定量分析了人血浆的microRNA,发现核糖核蛋白复合体中存在绝大部分人体循环中的microRNA,仅有一小部分的micro RNA 和囊泡发生关联。进一步研究发现,一部分特定的micro RNA (约为16%)仅存在于囊泡中;一部分仅存在于核糖核蛋白复合体,该部分在人体血清和血浆中分别占70%、69%;其余则在核糖核蛋白复合体和囊泡中均有存在[16]。

2 肺癌临床诊断及预后生物学标志物

2.1 肺癌诊断生物学标志物 部分研究人员利用特定技术对人体血清microRNA 表达谱进行探讨研究,分别采集11名健康男性、10 名健康女性及11 例非小细胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer,NSCLC)患者血清,通过对比发现,在NSCLC患者血清中检测到130种microRNA,但是其中62种在健康人群血清中并未发现,同时26种仅在健康人群血清中发现。进一步研究发现,NSCLC 患者血清中75 种microRNA 在血细胞中并未发现,表明该部分microRNA 可能来源于肿瘤微环境或者肿瘤细胞[17]。另一项研究在80例肺癌患者和80名健康体检人群中进行,使用实时荧光定量逆转录PCR 确定 micro RNA-223 和microRNA-225特异性的存在于肺癌患者体内[18]。尽管这两种micro RNA 水平较正常人群高,但仍需对其诊断价值进行进一步分析研究。

随后,研究人员重点关注体液中具有诊断价值的microRNA。有研究报道了肿瘤组织以及与其配对的血浆来源的外泌体中10 种 microRNA 水平,发现二者中microRNA 水平呈现高度的相关性[19],提示肿瘤本身状况可以通过肿瘤来源外泌体的microRNA 表达谱来反映,这为肿瘤来源外泌体的microRNA 表达谱在肿瘤发展、治疗及预后方面的价值提供了有力证据。有研究表明,血浆microRNA-21可以作为NSCLC 的诊断标志物,同时发现NSCLC患者分期与microRNA-21表达水平关系密切,T3、T4期患者较T1、T2 期患者血浆microRNA-21 表达水平明显升高。同时在使用以铂类药物为主进行化疗的患者中,进展期和稳定期患者血浆micro RNA-21表达水平显著高于缓解期患者[20]。

同时还可以通过定时定量PCR 阵列、微阵列、测序等方法测定患者microRNA 表达谱,然后通过独立的队列确定目标microRNA。研究人员通过研究发现,NSCLC 患者血清中90种micro RNA 特异性表达,同时又对300例健康人群和400例肺癌患者组成的研究对象进行研究,提出一种联合11种micro RNA 的诊断方法,并绘制其受试者工作特征曲线,其特异度为90.1%,敏感度为92.6%,曲线下面积为0.975[21]。部分研究提出,microRNA-1254 可以用来诊断早期NSCLC,研究人员使用芯片技术对10例健康人群和10例肺癌患者血清microRNA 进行检测,结果显示5种microRNA 表达水平差异倍数高达1.69倍[22]。另有研究 提 出, microRNA-574-5p 和 micro RNA-1254 诊 断NSCLC特异度为72%,敏感度为75%,联合诊断NSCLC疾病具有较高价值[23]。

microRNA 表达谱随着时间推移会不会发生变化也应引起高度重视。研究人员采集了肺癌确诊前3～30年患者血液样本、7份健康人群血液样本和10份确诊肺癌后患者血液样本,对样本中的905种microRNA 表达情况进行测定和分析,发现,microRNA 谱总体是稳定的,但是在肺癌确诊前后会发生明显变化[24]。但是本次研究难以将肿瘤发生发展与microRNA 表达水平变化之间的关系研究明晰。部分研究提出,使用联合35种microRNA 的诊断方法可以在没有肺癌症状的人群中检测出早期肺癌,准确率高达85%[25]。以上研究均表明micro RNA 可能在肺癌患者的症状表现出来之前已经进入患者血液。

2.2 microRNA 对肺癌治疗作用 近几年,人们将microRNA 合成为拮抗剂或者模拟物用来治疗肺癌成为一种新的治疗癌症方法。microRNA 作为治疗手段,其主要优点是可以同时作用于肿瘤发生、发展过程中的多个阶段。理论上来说,只需要几个micro RNA 即可使大量的肿瘤细胞沉默。病毒传递的最大特点是传递速度快、传递效率高。研究发现将腺病毒作为载体,将microRNA-122 传导至NSCLC患者细胞内,可以明显提高microRNA-122表达水平,甚至表达水平提高2 000倍以上,同时使内源性凋亡通路被激活[26]。

研究人员使用包含二甲基苄联氮的固体脂质纳米颗粒来浓缩microRNA,从而来提高细胞对microRNA 的摄取率。研究表明,人体肺组织可以在2 h内吸收通过静脉注射的含有microRNA-34的包含二甲基苄联氮的固体脂质纳米颗粒[27]。与脂质体颗粒相比,包含二甲基苄联氮的固体脂质纳米颗粒可以有效被人体肺毛细血管截留,还可以避免被肝脏清除,提高被肺部吸收的效率。同时外泌体microRNA 可以有效调控肿瘤,所以目前将外泌体作为一种传递治疗分子的方法成为新的治疗手段。目前,该种方法已被部分研究人员应用在临床上,并且取得一定的成果。通过外泌体向目标细胞中传导microRNA,能有效提高或者恢复目标细胞中microRNA 水平,即通过肿瘤抑制因子来发挥抑制作用。

目前,micro RNA 作为治疗肿瘤疾病的主要困难是安全性、脱靶效应和传递的组织特异性,最有效的途径是系统性地传递microRNA 抑制剂或者模拟物。但是目前最大的难题是肺癌患者microRNA 的提取。同时在整个过程中要避免穿透血管内皮、核酸酶的降解、人体肾脏的清除作用、人体的免疫反应和靶细胞的内吞等。因为microRNA可以同时影响数百种基因,所以microRNA 在部分细胞内发挥有益作用,但是在另外一些细胞则可以发挥有害作用,这也是研究人员需要进一步研究的课题[28]。

2.3 肺癌患者预后生物学标志物 研究已经证明microRNA 与人体许多信号通路关系密切,这些通路可以调控肿瘤侵袭等相关过程,比如干细胞特性、DNA 损伤修复、细胞增殖、转化、死亡等[29-30]。这启示人们可以将microRNA 表达谱作为疾病预后的重要生物学标志物。在实际操作中,已有大量研究表明microRNA 在肺癌患者预后中有重要作用。研究人员针对150例肺癌患者的研究发现,众多microRNA 中有6种可以较为准确的预测肺癌患者预后状况[31]。针对NSCLC 患者研究发现,microRNA-182表达水平与2 期患者以及鳞癌患者预后有密切关系。microRNA-200 家 族 中 有 2 种 micro RNA, 分 别 为microRNA-141和microRNA-200c表达情况与NSCLC患者预后关系密切,二者高水平表达则患者总生存期更短,同时二者表达差异在鳞癌患者中无明显差异,主要是在腺癌患者中差异表达[32]。

患者进行手术治疗后肿瘤组织样本无法获得或者肿瘤组织样本在肺癌确诊后才能确立,所以在转移癌细胞的多样性和疾病进展过程中分子变化方面作用弱化。研究人员采集了30例短期生存和30例长期生存的NSCLC患者血清样本,经研究发现有5种microRNA 在2组患者体内表达有明显差异。研究人员把这几种microRNA 组合在一起,疾病严重患者血钾竟高达9.36 mmol/L。同时,研究人员还发现,患者体内microRNA-21高水平表达与患者不良预后、临床分期、淋巴结转移等相关[33]。

3 结语

从与肿瘤密切相关的microRNA 被发现以来,寻找可以作为肿瘤生物学标志物的microRNA 成为近年来的一个热门话题,也掀起了一股针对micro RNA 的研究热潮。大量的研究人员和研究机构投入大量的精力来研究该项课题,这将为该项技术应用在临床奠定了良好的基础。近年来,microRNA 在肺癌疾病方面的诊断、治疗、预后价值不断被发现,甚至大量研究直接表明microRNA 可以用来诊断筛查肺癌,对肺癌病理分型、治疗、药物敏感性测试等方面有重要作用,但是距离广泛推广应用还有差距,我们还有大量的工作要做。大量的研究均是小样本研究,定量即时聚合酶链锁反应法内参基因的选择仍未达成一致意见,研究人员报到的研究结果尚未统一,这也为下一步研究人员研究提出了新问题。同时大部分研究结果缺乏长期跟踪研究。找到一种可以有效预测、监测治疗疗效的无创生物学标志物显得尤为迫切,但是研究结果差距较大。目前较为清晰的是microRNA 与铂类化疗的敏感性高度相关,但是其作为独立的生物学标志物价值不足。同时,能够分泌microRNA 的细胞种类、分泌机制及micro RNA 的作用仍未完全明晰,如果这些问题全部得到有效的彻底地解决,microRNA 在肺癌乃至各种肺癌诊断、治疗和预后方面生物学标志物的作用将得到充分发挥,这将为人们攻克肺癌提供有力帮助。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突