高效液相色谱法测定蛹虫草中喷司他丁的含量

张春杨，杨思广，张月，钱琨，周影，李冰

1. 吉林省蚕业科学研究院，吉林 吉林 132000；2. 吉林市食品药品检验所，吉林 吉林 132011；3. 德惠市园艺特产工作室，吉林 长春 130300

喷司他丁是一种抗肿瘤药物，多由目前已有文献从基因角度证实蛹虫草可以合成喷司他丁，其浓度水平与蛹虫草的品质和毒性有关。本研究对蛹虫草中喷司他丁含量检测的提取溶剂、提取时间、提取方法等参数进行单因素考察，并通过双因素完全试验确定了蛹虫草中喷司他丁含量测定的提取条件并将提取物经质谱鉴定确认。参照喷司他丁的高效液相色谱条件，检测了7种不同来源的鲜蛹虫草经烘干和冻干不同加工工艺后，喷司他丁的含量差异。发现冻干组处理后的蛹虫草中喷司他丁为烘干组的3-5倍。在检测中发现蛹虫草中的喷司他丁会随时间而分解，这也解释了前期预研实验中购买的干蛹虫草中很难检测到喷司他丁的原因。

蛹虫草Cordyceps militaris又名北冬虫夏草，由于其功效成分与冬虫夏草类似，与冬虫夏草相比又有较大的价格优势，目前在市场中的销售份额逐年攀升。中科院上海植物生理生态研究所王成树研究发现[1,2]，研究了蛹虫草中喷司他丁的含量检测方法。并比较了我单位生产的7种不同来源的鲜蛹虫草经烘干和冻干不同加工工艺后，喷司他丁的含量差异。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HERMLE Z36HK高速冷冻离心机；Thermo Fisher Scientific U-3000高效液相色谱仪（配DAD检测器）；Waters e2695-2998高效液相色谱仪（配DAD检测器）；HSC-24B水浴氮吹仪；JCX-600Z超声波清洗机；Waters H-CLASS/XEVO TQD液相色谱/三重四级杆串联质谱仪；Sartorius BSA224S-CW电子天平；IKA VORTEX3漩涡混合器。

1.2 试药 喷司他丁对照品（美国TargetMol）；乙酸铵：分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇：分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇：质谱级（德国默克）；乙腈：质谱级（德国默克）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：CHROM水相C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相：2.5 g/L乙酸铵溶液-甲醇-乙腈（96:2:2）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：282 nm；进样量10 μL。在此条件下，喷司他丁与其他色谱峰分离良好。

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 标准曲线的制备 精密称取喷司他丁对照品10 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为200 μg/mL的标准贮备液。再用水稀释标准贮备液，得到浓度分别为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的喷司他丁系列标准工作溶液。

2.2.2 试样溶液的制备 称取样品0.5 g，加水25 mL，超声处理10 min，加水补足减失的重量，取上清液，过0.45 μm滤膜，待测。

2.3 测定条件的选择 取适量的喷司他丁标准品溶液，在200-400 nm范围内进行紫外全波长扫描。喷司他丁在213 nm和282 nm处有最大吸收。考虑到在低波长下通常会有较多的杂质信号干扰，故最终选择282 nm作为检测波长。

3 讨论

3.1 柱温的选择 分别在柱温30 ℃和35 ℃条件下进行测定，因考虑实验效率问题，未建立净化方法，样品溶液中存在部分水溶性杂质，升高柱温使得各组分保留时间提前，导致喷司他丁分离度降低，故而确定柱温为25 ℃。

3.2 蛹虫草炮制工艺的改进方向 本次试验样品由吉林省蚕业研究院提供，院内采用高温烘干的方式对蛹虫草进行干燥处理。因喷司他丁热稳定性差，受热极易分解，在试验中发现新制成品中喷司他丁含量低，且分解后杂质较多，真空包装放置3个月后，喷司他丁含量基本降为0。蛹虫草有抗癌功效，其相关功效成分即为喷司他丁，由此可见，干燥工艺对蛹虫草功效起着至关重要的作用。本实验室后期采用冻干工艺，对小批量蛹虫草进行干燥处理，成品中喷司他丁含量与原工艺相比提高了3-5倍，极大改善了因喷司他丁受热分解而导致蛹虫草功效下降的情况。后续将从成本与经济效益方面，对蛹虫草的干燥工艺进行更深入的研究。