环介导等温扩增技术检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌*

司玉莹，赵望，叶蓓，成宇，张雯雁，叶杨芹，王玉超，王岚，范列英

(1. 同济大学附属东方医院检验科，上海 200120；2. 复旦大学环境科学与工程系，上海 200438)

呼吸道感染是一种常见并严重威胁人们身体健康的感染性疾病，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，Kpn)感染在呼吸道感染中居于前列[1]。目前Kpn临床检测常规方法是细菌培养法，需3 d左右，不利于早期诊断和治疗；菌种鉴定金标准是DNA测序法，设备昂贵、实验条件严格，不适于基层实验室推广应用。因此，临床上需要一种快速可靠的鉴定方法。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有特异性强，灵敏度高，扩增快速高效，操作容易等优点[2]，目前国内已有学者建立了应用于食品中Kpn检测的LAMP体系[3]。本研究拟建立一种用于检测呼吸道感染Kpn的LAMP方法，同时与细菌培养法、DNA测序法结果进行比较，评估该体系并初步临床应用。

1 材料与方法

1.1临床样本及菌株 收集2018年5—11月同济大学附属东方医院就诊的疑似呼吸道感染患者痰液样本308例，其中男性248例，女性60例，年龄范围19～95岁，年龄(66.39±12.81)岁。患者入院清洁口腔后采用自然咳痰法用力咳出深部痰或经吸痰管、纤维支气管镜气道内吸取法采集痰液样本，根据第4版《全国临床检验操作规程》[4]初步判断痰液样本是否合格。肺炎克雷伯菌ATCC 13883、铜绿假单胞菌ATCC 27853、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、大肠埃希菌ATCC 35218、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎链球菌ATCC 49619、流感嗜血杆菌ATCC 9007、卡他莫拉菌ATCC 25238、产酸克雷伯菌ATCC 700324均购自上海北诺生物科技有限公司，用于LAMP法的特异性、灵敏度试验。

1.2主要试剂与仪器 10×ThermoPol Reaction Buffer、Bst2.0 DNA聚合酶(New England Biolab公司)，LAMP引物、SYBR GreenⅠ、甜菜碱(Invirtrogen公司)，dNTP(天根生化科技公司)，MgSO4(Sigma公司)，核酸提取试剂盒(上海信长医疗器械公司)，血平板、巧克力平板、麦康凯平板(赛默飞公司)；核酸提取仪(上海复星医药集团)，7300型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Vitek 2 Compact全自动细菌分析仪(法国生物梅里埃公司)，Nanodrop 2000 超微量分光光度计(赛默飞公司)，DNA测序由上海生工生物工程公司完成。

1.3临床痰液样本细菌培养 收集痰液样本并于2 h内分别接种于血平板、巧克力、麦康凯平板上，37 ℃、5% CO2孵育24～48 h观察结果，分离潜在病原菌，应用Vitek 2 Compact全自动细菌分析仪进行细菌鉴定。

1.4核酸提取 痰液样本中加入等体积40 g/L NaOH液化[5]，室温放置30 min后轻柔混匀，避免出现大量泡沫，取液化样本300 μL；将标准菌株配制成108CFU/mL菌悬液[6]，取菌悬液300 μL。用核酸提取试剂盒在核酸提取仪上进行核酸提取，按照说明书进行。制备核酸用于LAMP 反应，余下-40 ℃保存。

1.5LAMP反应的建立

1.5.1LAMP引物 通过GenBank序列搜集和BLAST比对分析，选择KpnphoE基因[7]为靶基因，运用在线引物设计软件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)，针对6个区域设计4条特异引物：2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP，FIP由F1的一个互补序列和正向序列F2构成，BIP由B1的一个互补序列和正向序列B2构成)。LAMP引物信息见图1。引物序列如下，F3：5′-CCGACATTGTCACTGAGT-3′；B3：5′-CCTGAATACCGGAGGTGAT-3′； FIP：5′-GCTTTGATGTTCATTTGCGTTGAGACAAATATGCTGCAAATGTG-3′；BIP：5′-GCTTTGATGTTCATTTGCGTTGAGACAAATATGCTGCAAATGTGG-3′。

图1 LAMP引物信息

1.5.2LAMP反应条件优化 以Kpn标准株核酸为模板，进行LAMP扩增。反应体系为25 μL：10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5 μL、ddH2O(加入Mg2+和甜菜碱)18.5 μL、引物1 μL(包括F3 0.2 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、FIP 1.6 μmol/L、BIP 1.6 μmol/L)、BstDNA聚合酶1 μL、SYBR GreenⅠ1 μL、模板1 μL。反应温度63 ℃[8]、时间45 min，优化Mg2+和甜菜碱的浓度。分别在有、无Kpn模板的体系中加入4、6、8、10、12 mmol/L不同浓度的Mg2+，0、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L不同浓度的甜菜碱，观察实验结果以选择最佳扩增浓度。

1.5.3LAMP法特异性、灵敏度试验 采用优化后体系分别以肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、产酸克雷伯菌标准株核酸为模板，进行LAMP特异性验证；将原始浓度为108CFU/mL Kpn标准株菌悬液浓度梯度稀释[9]至107、106、105、104、103、102、101CFU/mL，取各浓度菌悬液300 μL进行核酸提取，制备的核酸用于LAMP灵敏度试验。

1.6LAMP法检测临床痰液样本 LAMP法检测308例临床痰液样本，样本提取核酸作为模板，ddH2O为阴性对照，Kpn标准株核酸为阳性对照，在7300型实时荧光定量PCR仪上采用已建立LAMP体系进行检测。Ct值≤30定义为阳性。

1.7DNA测序 将制备的临床痰液样本核酸用Nanodrop 2000超微量分光光度计进行质检，均符合测序要求(DNA纯度1.8～2.0，浓度30 ng/μL以上)，取20 μL样品量送至上海生工生物工程公司进行DNA测序。根据KpnphoE基因利用NCBI网站设计常规PCR引物，上游引物序列：5′-TGCCCAGACCGATAACTTTA-3′，下游引物序列：5′-CTGTTTCTTCGCTTCACGG-3′。引物与单链 DNA 模板分子结合后，DNA 聚合酶用 dNTP 延伸引物，混入限量的缺乏延伸所需要的3′-OH基团的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，使延长的寡聚核苷酸随机在某一个特定的碱基处终止，并在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G 结束的4组不同长度的一系列核苷酸，然后在PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA 碱基序列。

1.8统计学分析 用SPSS 20.0软件进行。阳性率比较采用χ2检验，方法学一致性检验采用Kappa检验(Kappa系数<0.4提示一致性差，>0.8说明一致性极好)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验与结果

2.1LAMP反应条件优化 Mg2+浓度为8 mmol/L、甜菜碱浓度为0.4 mmol/L时，核酸扩增出峰较早且无假阳性结果，确定为最佳扩增所需浓度。见图2。

注：A，Mg2+浓度优化；B，甜菜碱浓度优化。(+)，有Kpn模板体系；(-)，无Kpn模板体系。

图2Mg2+和甜菜碱浓度优化试验扩增曲线

2.2LAMP法特异性、灵敏度试验 以肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、产酸克雷伯菌标准株核酸进行LAMP检测，结果仅Kpn核酸为模板时获得阳性扩增曲线，而其余菌种均未获得扩增曲线。Kpn核酸模板浓度低至104CFU/mL时可获得阳性扩增，而其他更低浓度均未获得扩增，最终确认灵敏度达到104CFU/mL。见图3。

注：A，特异性试验(细菌标准株核酸分别为肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、产酸克雷伯菌)；B，灵敏度试验(模板分别为108、107、106、105、104、103、102、101CFU/mL Kpn菌悬液提取核酸)。

图3LAMP法特异性、灵敏度试验扩增曲线

2.3细菌培养法结果 308例痰液样本培养鉴定检出Kpn阳性样本130例、Kpn阴性样本178例(包括无细菌生长样本60例、非Kpn其他细菌阳性样本118例)，检出率为42.20%(130/308)。

2.4LAMP法检测临床痰液样本结果 308例痰液样本LAMP法检测阳性166例，阴性142例，检出率为53.89%(166/308)。LAMP 法检出率(53.89%)高于培养法(42.20%)，差异有统计学意义(χ2=161.65，P<0.05)。Kpn阳性样本中LAMP法与细菌培养法一致率为96.15%，无细菌生长样本的一致率为100%，而非Kpn其他细菌阳性样本的一致率为65.25%。见表1。

表1 LAMP法与细菌培养法的比较

2.5DNA测序验证 各样本测序结果峰图均显示波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀，底部无杂峰干扰，将测序结果进行BLAST比对，证明确实为Kpn。见图4。对表1中46例LAMP法与细菌培养法结果不一致样本进行DNA测序鉴定， LAMP法与测序结果一致40例，假阴性2例、假阳性4例，符合率为86.95%(40/46)。其中LAMP法阴性的5例样本测序结果为2例阳性、3例阴性，LAMP法阳性的41例样本测序结果为37例阳性、4例阴性。除上述46例不一致样本外，另随机选择85例结果一致的样本，共计131例进行DNA测序后，与本研究建立的LAMP法结果进行比较，结果显示LAMP法与测序有极好的一致性(Kappa系数=0.817)。见表2。

注：Kpn阳性样本正向测序结果(上图)和反向测序结果(下图)。

表2 LAMP法与DNA测序法检测Kpn的比较

3 讨论

本研究针对KpnphoE基因自行设计LAMP引物，对Mg2+、甜菜碱浓度进行了优化，并利用细菌标准株证明自行设计引物具有较高的特异性和灵敏度。以测序结果为金标准，进行ROC曲线分析，LAMP诊断Kpn的cut off值为30(Ct值)，该水平的灵敏性为75.00%，特异性为87.50%。

本研究对308例疑似呼吸道感染患者痰液样本进行LAMP检测，与细菌培养法、DNA测序结果进行比较，评估Kpn的LAMP检测体系。结果显示Kpn阳性和无细菌生长样本中LAMP法与细菌培养法一致率较高，而非Kpn其他细菌阳性样本中，一致率较低(65.25%,77/118)，不一致的41例(LAMP检测Kpn阳性而细菌培养法阴性)测序结果为37例阳性、4例阴性，可见相比细菌培养法，LAMP技术在筛查Kpn病原体中具有更高的灵敏度，与国内外文献报道结果一致[10-11]。产生此差别的可能原因：LAMP技术是针对病原体靶基因的快速检测手段，可以有效避免传统培养法在检测多重感染样本时因某些细菌优势生长而导致的漏检；因痰液样本的复杂性，LAMP技术可检出少量或死亡菌体的基因，造成假阳性，多项研究也表明培养结果和基因筛检方法之间存在差异[12]。本研究建立的LAMP法与测序结果进行比较，显示两者具有极好的一致性(Kappa系数=0.817)，与文献报道描述一致[11]。

LAMP技术具有准确性高、灵敏度高、特异性强、反应省时等优势，已被成功开发并应用于病原微生物检测[13]。目前国内已有LAMP恒温扩增仪生产，只需要恒温装置和荧光检测系统，比常规实时荧光定量PCR仪更加体积小巧，便于操作，价格低廉。但LAMP法也有一定不足，例如无法提供药敏信息，只能做定性分析，在复杂性痰液样本中基因筛检与真实致病情况存在差异等，应该结合细菌培养结果和临床实际情况判断。