汉江流域上游城镇污水CAST处理工艺微生物群落结构分析

2020-03-02蒙小俊龚晓松王秋利

安康学院学报 2020年1期

蒙小俊，龚晓松，王秋利

（安康学院旅游与资源环境学院，陕西安康 725000）

发源于陕南秦巴山地的汉江流域是丹江口水库的主要水源地，生态承载力处于弱可承载状态，支流污染严重、生态环境质量差、潜在威胁多，保护水源地生态环境质量，确保南水北调中线工程水质安全、促进区域经济发展、实现人与自然和谐共处一直是相关管理部门和学术界关心的热点问题[1-2]。城镇污水排放是汉江流域上游面临的主要环境问题之一，污水处理厂能够净化水质，改善环境，已成为汉江流域生态环境保护所必备的设施。汉江上游城镇污水处理厂主要采用CAST、氧化沟、A2/O和BIOLAK工艺，占比分别为46%，29%，21%和4%。CAST工艺具有投资及运行费用低、运行简单灵活及其选择器能防止污泥膨胀等优点[3]，可实现好氧、缺氧及厌氧状态交替的环境，为同步脱氮除磷提供了有利条件，特别适合陕南多山少地地区的污水处理。

国内外科研工作者对CAST工艺做了大量的相关研究[3-7]，但对工艺中起重要作用的微生物群落结构和功能鲜见分析。生物处理过程污泥相由复杂的微生物群落组成，以细菌为主的群落结构在废水处理过程中起至关重要的作用，生物群落决定废水的处理效率，废水处理系统功能的稳定性主要依靠优势微生物的活性和多样化的群落结构间的相互关系[8-10]。地球上存在106～108种微生物，而且其中绝大多数无法通过常规方法获得纯培养[11]。随着生物新技术的发展，城镇污水处理中的种群结构受到广泛关注。研究表明，城市生活污水中细菌种类比高氨氮废水更丰富，优势菌群属于Proteobacteria和Bacteroidete，而高氨氮废水系统中AOB与NOB的数量都多于城市生活污水系统[12]；污水处理厂进水中AOB优势菌为Nitrosomonas，NOB的优势菌为Nitrospira，次优势菌为Nitrobacter，且与Nitrococcus、Nitrospina 并存[13]；Nitrosomonas、Nitrospira和Thauera菌是城镇污水处理中检测到的典型的AOB、NOB和反硝化菌，分别占5.82%、2.26%和4.30%[14]95；BIOLAK活性污泥中，参与氮、芳香化合物和磷代谢的功能基因比例分别为2.50%、2.28%和1.56%，氮代谢过程中，反硝化相关基因所占比重最高，达到80.81%，其次是氨化（12.78%）、硝化（4.38%）和固氮（2.04%）[15]。尽管在城镇污水处理中的微生物群落结构和功能研究上取得了一定成果，但不同处理工艺和水质严重影响微生物群落结构，而汉江流域上游CAST处理工艺群落结构和功能鲜见报道。由此对CAST工艺微生物进行分子生态学研究，有助于探讨废水处理工艺动态监控和优化控制，保证水源涵养地的水质安全，保障南水北调中线工程供水的安全运行。本研究对采自汉江流域上游安康市某城镇污水厂CAST处理工艺的微生物群落结构和功能进行分析，以期为废水处理工艺的稳定运行和优化控制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）、Qubit3.0 DNA检测试剂盒（Life）、2×Taq Master Mix（Vazyme）、MagicPure Size Selection DNA Beads（Transgen）。

1.2 实验主要仪器

台式离心机（Thermo Fishe）r、电泳槽（北京市六一仪器厂）、凝胶成像系统（美国UVP）、Qubit3.0荧光计（Invitrogen）、PCR仪（BIO-RAD）。

1.3 采样

污泥采自汉江流域上游安康市某城镇污水处理厂（样品采集3个平行样），该污水处理厂采用CAST工艺，工况依次为进水、曝气、沉降、滗水，每个工况运行1.5h，每个周期运行6h。主要水质指标见表1。

表1 污水处理厂生化单元主要水质指标（mg/L）

1.4 DNA提取、PCR和16S r DNA测序

DNA提取按照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒说明进行。琼脂糖凝胶检测DNA完整性，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量（3个样品DNA提取后等比例混合后作为后续的测试样）。PCR扩增引物：341FCCTACGGGNGGCWGCAG和805RGACTACHVGGGTATCTAATCC，扩增区域为V3-V4。反应条件：94℃3min，94℃ 30s，45℃ 20s，65℃ 30s，5cycles；94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，20cycles；72℃ 5min，10℃。反应体系：2×Taq master Mix 15μL，Bar-PCR primer F（10μM） 1μL，Primer R（10μM） 1μL，Genomic DNA 10-20 ng，ddH2O 补至 30μL。PCR按上述条件和体系结束后进行第二轮扩增。第二轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物。PCR反应条件：95℃ 3min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，5cycles；72℃ 5min，10℃。PCR 反应体系：2×Taq master Mix 15μL，Primer F （10μM） 1μL，PrimerR（10μM） 1μ L，PCR产物（第一轮） 20ng，ddH2O补至30 μL。PCR结束后产物经琼脂糖电泳检测，纯化后进行高通量测序。

1.5 多样性及群落结构分析

原始序列数据预处理后利用Prinseq软件进行质控，采用Usearch软件在97%的相似水平下进行生物信息统计分析，物种分类采用RDP classifier软件进行。根据物种丰度情况，使用软件Mothur中的summary.single命令，计算菌群Chao、ACE、Shannon、Simpson多样性指数。通过在线平台进行LEf Se分析，并使用PICRUSt软件，利用直系同源蛋白（COG）和京都基因百科全书（KEGG）基因数据库进行比对（BLAST比对参数设置期望值为10-5），根据比对结果使用KOBA2.0进行功能注释。

2 结果与分析

2.1 污泥菌群多样性和组成

经测序，污泥样品获得44896条有效测序条带，OUT、Chao、 ACE和 Shannon指数分别为4031、15926.67、27300.6和5.83，覆盖率为94%。为了解微生物群落结构组成和丰度，分别从微生物门（phylum）水平（见下页图1）和属（genus）水平（见下页表2）进行分类。如图1所示，微生物优势门是Proteobacteria，丰度为40.31%；其次为Bacteroidetes、Chloroflexi、Planctomycetes、Candid-atus Saccharibacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia、Acidobacteria、Firmicutes和 Nitrospirae，丰度分别为16.85%、13.97%、6.21%、4.59%、3.83%、3.81%、2.4%、1.47%和0.64%；未分类和其他分别占4.48%和1.45%。这与相关研究结果一致，Proteobacteria是污泥中微生物门水平上的主导门类[14,16]。

图1 微生物群落结构门水平上的分类

微生物群落结构在属水平上的组成和丰度（丰度大于0.5%）如表2所示，优势属为Saccharibacteria、Zoogloea和 Gemmobacter，丰度分别为4.59%、3.94%和 3.5%，其次为 Ilumatobacter、Limnohabitans、Kofleria、Aridibacter、Rubinisphaera、 Phaeodactylibacter、Acidovorax、Ferruginibacter、Terrimonas、Flavobacterium、Dokdonella、Thermomonas、Methylotenera 、 Arcobacter、Acinetobacter、 Haliscomenobacter、 Nitrospira、Gimesia、Thauera、 Runella、Azospira和Dechloromonas，丰度分别为 1.8%、1.62%、1.52%、1.47%、1.27%、1.27%、1.25%、1.19%、1.13%、1.04%、0.93%、0.89%、0.78%、0.76%、0.73%、0.68%、0.63%、0.62%、0.56%、0.55%、0.54%和0.51%。Zoogloea是兼性好氧细菌，在许多污水处理厂活性污泥中都占优势地位，能降解有机物，可脱氮除磷[17]；Nitrospira是活性污泥中起硝化作用的主要菌属[18]；活性污泥中与反硝化作用有关的主要菌属包括：Azoarcus、Thauera、Comamonas、Rhodobacter、Rhodocyclus 和 Dechloromonas 等[19]，本研究中发现了Thauera、Comamonas和Dechloromonas菌，这些菌株可能参与反硝化作用；同时Dechloromonas具有除磷功能[20]。Terrimonas菌能发生好氧反硝化[21]，而反硝化菌Azospira属聚磷菌的一种，可以进行污水除磷[22]，Flavobacterium菌被证明具有解磷作用，能将周围环境中的有机磷转化为无机磷[14]97。以上数据表明CAST生物系统具有良好的脱氮除磷性能。

表2 微生物群落结构属水平上的分类

2.2 活性污泥中的基因功能分析

活性污泥中的基因功能分析如表3所示，与碳水化合物的新陈代谢、氨基酸的新陈代谢、氮素代谢和甲烷代谢相关的基因丰度分别为3.15%、8.64%、0.74%和1.04%。主要的碳水化合物正常的代谢途径包括糖酵解、三羧酸循环和碳水化合物的运输，这是典型高效的活性污泥中微生物能量产生和生物合成的过程[14]99，糖酵解和三羧酸循环的基因丰度分别为1.04%和0.85%。COG注释分析表明CAST工艺污泥中与微生物新陈代谢相关的基因占36.11%，其中氨基酸转运和代谢、能源生产和转换、碳水化合物的运输和新陈代谢、无机物运输和新陈代谢分别占7.54%、6.01%、5.50%和5.08%，这与表3的结果基本一致。细胞壁和细胞膜占6.73%，这对于生物膜形成有重要意义，微生物在形成和降解EPS时会比较活跃。