避雨栽培对梨树根际土壤细菌群落的影响

陈小明，曾少敏，黄新忠

（福建省农业科学院果树研究所／福建省落叶果树工程技术研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意义】避雨栽培是目前常用的一种梨树种植方式，具有减少花期雨季落花、提高坐果率、缩短果实成熟时间、提高果实品质和减少病虫害等优势[1−3]，而避雨栽培改变果园微域环境，特别是土壤环境，因而研究其对根际土壤细菌群落的影响，对完善避雨栽培下土壤管理措施具有重要意义。【前人研究进展】近些年来随着梨树种植的增加，梨树病虫害和恶劣的自然环境对梨品质和产量的相关报道越来越多[4−6]。为减少病虫害以及自然灾害对梨品质和产量的影响，避雨栽培模式在梨树种植的应用越来越多。避雨栽培下梨锈病和梨黑斑病的发病指数要明显小于露天栽培[7]，且改善梨的外观，果实可溶性固形物和可溶性总糖含量都分别提高，可滴定酸含量和果实硬度都显著下降[8]。避雨栽培对梨品质和产量的研究相对较多，但避雨处理对梨树土壤的影响等研究相对较少，陈小明等[9]研究发现避雨栽培会减小梨树根际土壤酶活性。植物根际有一个复杂的微生物群落，它直接影响着植物的生长、健康和发育，根际微生物的群落结构受植物根际分泌物和土壤环境的影响[10−11]。【本研究切入点】避雨措施会影响梨树的生长，这势必会改变梨树的根际土壤环境，但对于避雨栽培下梨树根际土壤微生物的影响还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究以同一梨园中避雨栽培和露地栽培的梨树为研究对象，测定梨果实品质、土壤理化性质和土壤微生物多样性，比较不同模式下梨树根际土壤根际微生物的变化与果实品质和土壤化学性质变化的相关性。为制定不同栽培模式下定向调控土壤微环境、提高水果品质和保护土壤环境等措施提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 试验地点

试验果园为福建省建宁县溪口镇枧头村67 hm2（约40 000棵）30年生翠冠梨山地果园（东经116°48′34″，北纬26°50′38″），其中11.3 hm2（约6 800棵）从2013年开始采用盖棚避雨栽培（TYGH），其余为无盖棚露地栽培（TY）。

1.2 梨果实品质分析

2018年7月14日进行梨的果实取样，取样方法为，按照5点取样法，在避雨栽培区和露地栽培区各随机选取5棵梨树。在每棵梨树的上层和下层的不同方位按东、西、南、北4个方位上，代表性的采4个果实，每棵树共采8个果实，每个处理共采40个。样品放入冰盒保存，当天带回实验室进行果实品质分析。

将带回实验室的果实，每个处理随机选择10个果，去皮后取中部果肉切碎混匀，重复4次。果实品质分析的测定参照中华人民共和国食品安全国家标准测试。测试方法如下：蔗糖含量测定采用《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》（GB/T 5009.8—2016）[12]，还原糖含量测定采用《食品中还原糖的测定》（GB/T 5009.7—2016）[13]，抗坏血酸含量测定采用《食品中抗坏血酸的测定》（GB/T 5009.86—2016）[14]，总酸含量测定采用《食品中总酸的测定》（GBT12456—2008）[15]。

1.3 土壤取样

随机选取避雨栽培的5株健壮梨树，同时在露地栽培区也随机选取5株健壮梨树，在距离树干1 m处，用铁铲挖10～20 cm深达梨树根，将树根取出，将根表面土壤刷下，然后把所有根系上刷下来的土壤剔除树根，充分混匀，每棵取500 g左右，共计2 500 g。带回实验室保存于冰箱（−4 ℃）备用。

1.4 土壤化学测定

土壤样本取部分进行自然风干，碾碎，过2 mm筛，按四分法取样，参照《土壤农业化学分析方法》方法[16]，测定土壤的pH值和全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾以及有机质含量和含水量，所有指标测定均重复3次。具体如下：

1.4.1 土壤全氮和速效氮测定 速效氮含量包括测定的铵态氮和硝态氮含量的总和，铵态氮含量采用奈氏试剂法进行测定；硝态氮含量采用紫外分光光度法进行测定。全氮测定时先采用重铬酸钾硫酸消解法进行消解，再采用凯氏定氮法进行测定。

1.4.2 土壤全磷、全钾、速效磷和速效钾测定 用NaHCO3浸提土壤样品后采用钼锑抗比色法进行速效磷含量测定。利用NH4OAc浸提土壤，然后采用火焰光度法进行速效钾含量测定。全磷和全钾测定时先采用H2SO4-HClO4法进行消煮分解，再采用测定速效磷和速效钾的方法进行测定。

1.4.3 土壤有机质、pH和含水量测定 采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法进行土壤有机质含量测定。

pH值测定简述为：取10 g土于250 mL烧杯中，加入25 mL无二氧化碳水，充分搅拌后平衡30 min。取上层清水，将校正好的pH计电极放入测定pH。

含水量测定简述为：先称取铝盒重量a，记录后加入新鲜土壤，记录铝盒和土壤的总重量m，放入烘箱100 ℃，24 h，后取出放在干燥器中冷却，称量铝盒和土壤的总重量b。土壤含水率=[（b−a）/（m−a）]×100%。

1.5 土壤DNA提取和测序

土壤总DNA的提取采用MoBio PowerSoil DNA isolation kit（Carlsbad, CA, USA）。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度法对提取到的DNA样品进行质量检测。将检测合格的样品于−20 ℃保存备用。采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物对细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增[17]。PCR反应体系为25μL，包括12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix，3 μL BSA（2 ng·μL-1）， 2 Primer（5 μM）， 2 μL模板DNA，和5.5 μL ddH2O。反应参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min[18]。每个样品重复3次，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN, Germany）凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；利用RT-PCR进行定量，PCR产物送北京奥维森基因公司进行测序。

1.6 生物信息学分析

通过Illumina MiSeq平台进行Paired-end测序，下机数据经过QIIME（v1.8.0）软件过滤、拼接、去除嵌合体，去除打分低（≤20），碱基模糊，引物错配或测序长度小于150 bp的序列[19,20]。根据barcodes规类各处理组序列信息聚类为用于物种分类的OUT（Operational Taxonomic Units），OTU相似性设置为97%（Edgar，2013）[21]。对比silva数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息[22]。再利用Mothur软件（version 1.31.2）进行α多样分析（包括Shannon和Chao1等2个指数）[23]。基于Weighted Unifrace距离，使用R（v3.1.1）软件包的pheatmap进行聚类分析[24]。经过UniFrac算法利用系统进化的信息来比较样品间物种群落差异，并进行Beta多样性（Beta diversity）分析[25]。利用LEfSe分析进行不同处理根际细菌在丰度上有显著差异的细菌[26]。

1.7 数据分析

使用DPS软件分析数据，采用LSD法（最小显著差法）进行显著性差异分析，IBM SPSS Statistics 19.0进行数据的相关性分析，Umetrics SIMCA 13.0软件进行数据的主成分分析，并采用OriginLab OriginPro 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 梨树果实品质分析

梨果实品质测定结果表明，梨树避雨处理的果实蔗糖、还原糖含量要显著高于露地处理的，分别提高1.83倍和1.08倍，同时维生素C和总酸含量要显著低于露地处理的，分别减少了1.23倍和1.20倍（表1）。避雨处理果实的糖酸比要比露地处理的高19.45。可见避雨处理有利于提高果实糖含量和降低酸含量，提高果实的糖酸比，从而有可能改善风味品质。

表 1 不同栽培模式下梨果实品质Table 1 The pear fruit qualities under different cultivation modes

2.2 梨园土壤化学性质

土壤化学性质测定结果表明，在避雨处理的土壤速效磷、速效钾、有机质含量和含水量都要显著低于露地处理，全钾、速效氮含量和pH值都与露地处理没有显著差异，全氮含量显著高于露地处理（表2）。可见露地处理利于土壤速效磷、钾含量、有机质和含水量的提高，可能对果实的产量有重要作用。

表 2 不同栽培模式下梨树根际土壤化学性质Table 2 Chemical properties of soils from different treatment plots

2.3 梨园土壤微生物测序分析

2.3.1 微生物序列分析 对梨树根际土壤微生物测序结果表明，避雨处理的RT（Raw_tags）数量和CT（Clean_tags）要显著低于露地处理，但最终的OUT数目要显著高于露地处理（表3）。说明避雨处理的梨树根际土壤微生物数量更多。

表 3 梨树根际土壤微生物序列拼接结果和OUT数目统计Table 3 Sequence alignment and OUT number statistics of pear rhizosphere soil microorganism

图 1 不同栽培模式下梨树根际土壤细菌群落的门级（A）和属级（B）分类组成Fig. 1 Taxonomic composition of bacterial communities in the rhizosphere soil of pear trees at the phylum level and genus level under different cultivation modes

2.3.2 梨园土壤微生物α多样性和丰富度 避雨处理的梨树根际土壤在门水平的细菌群落主要以变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteria）为主（图1-A）；在属水平的细菌群落主要以不可培养细菌（uncultured bacterium）、不可培养的森林土壤细菌（uncultured forest soil bacterium）和不可培养的变形菌（uncultured proteobacterium）为主（图1-B）。避雨处理的梨树根际土壤细菌群落的平均Shannon指数（香农指数）和Chao1都要大于露地处理的，避雨处理显著提高土壤细菌的多样性（P＜0.05）。可见，避雨处理可以提高梨树根际土壤细菌群落的丰富度和多样性（图2）。

图 2 不同栽培模式下梨树根际土壤细菌群落的α多样性（香农指数A）和丰富度（B）Fig. 2 The alpha diversity（Shannon index, A）and abundance（Chao1, B）of rhizosphere soil bacteria of pear trees under different cultivation modes.

2.3.3 梨园土壤微生物β多样性 PCA分析结果表明，主成分1可以很好地区分避雨处理和露地处理的梨树根际土壤细菌群落，主成分1解释变量方差的74.31%（图3）。

图 3 不同栽培模式下梨树根际土壤细菌群落主成分分析Fig. 3 rincipal component analysis of bacterial community in pear rhizosphere soil under different cultivation patterns

2.3.4 梨园土壤微生物分类构成 从图4可以看出，避雨处理会使梨根际微生物产生差异。避雨处理的梨树根际微生物Gemmatimonadales、Chloroflexi、Nitrosomonadales、Thermoleophilia、Sphingomonadaceae、Streptomyces、Candidatus Koribacter、Hyphomicrobiaceae、Micrococcales、Micromonosporales、Acidimicrobiales、Corynebacterium、Anaerolinea的数量要显著大于露地处理。露地处理梨树根际微生物Solibacterales、Actinospicaceae、Corynebacteriaceae、Acidothemceae、Frankiales、 Chitinophagaceae、 Sphingobacteriales、Thermogemmatisporales、Roseiarcaceae、Acetobacteraceae、Rhodospirillales、Alcaligenaceae、Burkholderiaceae、Polyangiaceae、 Myxococcales、 Deltaproteobacteria、Xanthomonadaceae的数量要显著大于避雨处理。

2.4 相关性分析

梨树不同管理处理的根际土壤微生物在属水平与土壤理化性质相关性结果表明（图5-A），主成分1解释了变量方差的87.41%，主成分2解释了变量方差的10.26%，梨树根际属水平微生物差异相关系数绝对值最高的是土壤速效钾含量。与露地处理根际属水平微生物差异相关系数最高的是土壤速效钾含量，而避雨处理梨树根际属水平微生物差异相关系数绝对值最高的则是土壤总氮含量。说明避雨处理对微生物属水平影响最大的是土壤氮素水平。果实的蔗糖含量与避雨处理梨树根际属水平微生物差异相关系数最高，果实的总酸含量与露地处理梨树根际属水平微生物差异相关系数最高（图5-B）。说明避雨处理可能通过影响土壤微生物来影响果实品质。

3 讨论

避雨设施栽培的应用是减少作物病虫害、提高作物产量和品质的一个重要措施[3,27−29]。本研究发现山地避雨处理会提高梨的甜度，同时减少梨的总酸含量，该结果与前人的研究结果一致[3,8,30−32]；陈小明等[9]对田地避雨栽培研究表明，田地避雨栽培并没有提高梨果实总的含糖量，但酸性物质含量有所增加，这与本研究结果不同，可能是由于田地与山地立地条件不同，土壤水肥养分积累及消耗能力不同。相对于田地，由于山地早晚温差大，紫外线强，梨树生长过程中应激响应大，梨树吸收矿质营养元素的效率更低，导致果实的酸度大。同时，相关性分析发现，避雨处理土壤微生物属水平上的变化趋势与梨的蔗糖含量和还原糖含量相关性最大，通过定向调控土壤微生物种群的变化，提高梨的品质。

李艳丽等[33]利用土壤覆盖管理方式研究不同土壤管理方式差异对梨园土壤微生物的影响，发现盖膜处理使土壤中的速效养分减少，而本研究中避雨栽培降低了土壤中速效磷、速效钾、有机质含量和含水率，两者研究结果一致。这可能是由于避雨处理梨树生长的要比露地处理的好，需要的土壤速效营养物质更多，最终导致果实品质更好。梨树生长需要土壤提供有效的养分和水分，在同等情况下，避雨处理防止了雨水进入土壤，减少了土壤含水率，就可能减少了土壤中可溶性养分的溶解与释放。本研究中相关性分析发现避雨处理土壤梨根际微生物的变化和土壤总氮、速效氮和pH显著正相关，而氮素是植物生长主要的营养元素。因此，可以通过调控梨园的氮素水平来调控土壤根际微生物。植物可以改变根际土壤微生物，根际土壤微生物也可以显著影响植物的生长、发育和对土源性病原体的抗性[34]。本研究发现避雨处理可以增加梨树根际土壤微生物的α多样性和丰富度，而微生物多样性和丰富度的增加可以提高根际微生态的稳定性和抗性。相关研究表明利用盖膜方式管理梨园可以增加梨树土壤微生物数量[33,35]，这与本研究结果一致。虽然，避雨处理虽然降低了土壤中K、P等有效养分和水分含量，但植物生长得更好，分泌更多的根系分泌物可以为根际微生物提供更多的营养物质，这可能是导致避雨处理梨树根际土壤微生物的多样性和丰富度要高于露地处理的原因。

图 5 不同栽培模式下梨树根际土壤细菌群落的属级分类下与土壤理化性质（A）和梨品质（B）的相关性分析Fig. 5 Correlation analysis between bacterial communities in the rhizosphere soil of pear trees at the genus level and the soil physio-chemical indexes（A）and fruit qualities under different cultivation modes

4 结论

生产实践结果证明避雨栽培对于梨的产量和品质都有提高作用。本研究表明，在山地种植的梨树，避雨栽培可以提高增加土壤微生物多样性和丰富度，增强梨树根际微生态系统的稳定性，增加梨树的抗逆性，从而提升梨树果实的品质。但是长期的盖棚对于土壤物质循环不利，不利于维持作物的长期生长需求。由于梨树避雨栽培更有利于植株生长，根系分泌物也较多的，这导致了土壤微生物数量和多样性有所增加，但是避雨处理不利于整个土壤物质循环，需要适度的补充肥料和水分。田间实际生产过程中应考虑长期的避雨处理带来的负面影响，通过适当的露地敞开时间可以改善土壤物质循环，有利于梨园生产的可持续和稳定性。