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镁对生长期艾纳香内源激素、产量和有效成分积累的影响

2020-03-02蓝惠萍张影波陈晓鹭陈振夏庞玉新于福来

福建农业学报 2020年12期
关键词:内源单株药材

王 丹,蓝惠萍,张影波,胡 璇,陈晓鹭,陈振夏,庞玉新,于福来

(1. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/海南省艾纳香工程技术研究中心,海南 海口 571101;2. 广东药科大学中药资源学院,广东 云浮 527500)

0 引言

【研究意义】艾纳香为菊科艾纳香属植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.的 叶 及 嫩 枝,贵 州省、云南省和海南省是其主产区。艾纳香有祛风除湿、温中止泻、活血解毒等功效[1−2]。《中国药典》规定艾纳香是提取天然冰片(艾片)的唯一来源,主要有效成分为单萜类成分l-龙脑[3],现代药理学研究发现,l-龙脑具有抗炎、抗氧化、抗辐射、镇痛、促进药物吸收、促进烫伤皮肤恢复、提神醒脑等作用[4−5],因此,被广泛应用于医药、化妆品等领域。镁元素是植物所必需的营养元素之一,在植物的生理生化过程中起到非常重要的作用。镁素具有影响植物光合生理过程、调节酶活化功能、影响活性氧代谢、碳氮代谢以及植物基因表达等作用[6−7],并且镁可以显著提高药用植物药材产量以及促进药材有效成分的积累[8]。王丹等[9]研究发现,在海南冬季,外源施加镁可以显著增加艾纳香叶片生物量,对艾纳香有效成分l-龙脑百分含量增加无显著促进作用,但显著促进了艾纳香l-龙脑单株产量的积累。以此为基础,本文深入研究不同浓度镁对生长期艾纳香药材产量和内源激素以及l-龙脑积累变化的影响,确定最适宜的施镁浓度,为实际栽培生产中艾纳香施镁提供数据支持和科学指导,以生产出高产、高质的艾纳香药材。【前人研究进展】研究学者发现,施肥可以显著提高艾纳香药材产量。何元农等[10−11]证实3种农家肥、3种一元化肥、复合肥和单独施用氮肥均对艾纳香的产量和有效成分的积累有显著促进作用。王丹等[9,12,13]研究发现,在海南冬季,此时艾纳香生长进入迟缓期,此时施用钙、镁、锰以及植物生长调节剂萘乙酸、赤霉素和DA-6均有益于艾纳香生长发育,促进艾纳香叶、茎和根生物量的增加以及有效成分l-龙脑单株产量的积累。蓝惠萍等[14]发现氮、磷、钾配施可以显著促进艾纳香药材产量和有效成分l-龙脑相对含量的积累,对产量积累影响作用依次为氮>钾>磷。王丹等[2]证实10.0 mg·mL−1镁处理对2年生艾纳香药材产量和质量的提高效果最好,1年生艾纳香苗在生长期施加镁可以促进艾纳香生长,提高叶片生物量,显著促进磷、钾和镁元素积累,抑制钙和铁的吸收,对氮元素影响不显著,15.0 mg·mL−1镁素处理组锰、锌和铜含量最低[15]。【本研究切入点】镁对生长期的艾纳香苗药材产量以及内源激素含量和l-龙脑积累变化的影响研究未见报道。【拟解决的关键问题】本试验以1年生艾纳香为试验材料,研究不同施镁水平对艾纳香药材产量和艾纳香叶片中内源激素赤霉素(GA3)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素(ZR)含量的影响变化,以及有效成分l-龙脑百分含量和l-龙脑单株产量的变化情况,以期为合理施肥,提高艾纳香药材产量和品质提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年7月9日,选择长势一致的艾纳香种子苗(经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所于福来副研究员鉴定为艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.)为试验材料,采用水培的方式,基质为珍珠岩,以Hoagland营养液为艾纳香提供营养成分。Hoagland营养液中各组分的质量浓度分别为:KH2PO4136 mg·L−1、H3BO32.86 mg·L−1、CuSO4·5H2O 0.08 mg·L−1、ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L−1、Na2MoO4﹒2H2O 0.52 mg·L−1、MnSO4·H2O 1.81 mg·L−1、Fe-EDTA 2.5 mg·L−1、KNO3510 mg·L−1、Ca(NO3)2945 mg·L−1。每天补充1次水分,每隔7 d补充1次营养液。分别

于当年8月15日和9月1日进行叶面喷施镁,以MgSO4·7H2O提供镁素,共设置3个质量浓度为1.5、15.0、150.0 mg·mL−1,以 不 含 镁 的 营 养 液 为 对 照(CK),处理120 d,每30 d取样1次,共取样4次。测定艾纳香药材产量以及药材有效成分l-龙脑百分含量和l-龙脑单株产量,以及艾纳香叶片中内源激素GA3、IAA、ABA、ZR含量。

1.2 试验方法

1.2.1 药材产量的测定 取艾纳香的嫩枝和叶片,阴干后用电子秤测量其药材产量。

1.2.2 l-龙脑百分含量测定 采用气相色谱法(GC)测定艾纳香中l-龙脑百分含量[2]。取艾纳香叶,精密称量3.000 g置于50 mL具塞试管中,加入乙酸乙酯24 mL,封口,超声处理40 min,静置并抽滤,滤液转移至25 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至25 mL,摇匀,精密移取2.0 mL到10 mL容量瓶中,水杨酸甲酯作为内标液,加入1.0 mL,然后加乙酸乙酯稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。使用HP-5石英毛细管色谱柱(0.32 mm×30 m,0.25 μm),起始温度50 ℃,保持2 min,先以5 ℃·min−1升温至100 ℃,然后以20 ℃·min−1升温至200 ℃,保持3 min;进样口温度220 ℃;检测器温度240 ℃;进样量为0.6 μL,不分流。

1.2.3 l-龙脑单株产量的计算 将l-龙脑百分含量与艾纳香单株药材产量相乘,得l-龙脑单株产量。

1.2.4 4种内源激素含量测定 取相同部位的艾纳香成熟叶片,采用酶联免疫吸附法测定GA3、IAA、ABA、ZT含量。试剂盒购自中国农业大学作物化学控制研究室。样品处理方法:取艾纳香叶片1.0 g于液氮中速冻,用80%甲醇溶液(含二叔丁基对甲苯酚(BHT) 1 mol·L−1)匀浆,4 ℃提取8 h,离心率为4 000 r·min−1离心15 min沉淀,再用80%甲醇重复提取3次,合并上清液,采用C-18固相萃取柱法去掉艾纳香叶片叶绿素,氮气吹干,PBSTG溶解定容,用于酶联免疫检测仪测定[16]。

1.3 数据分析

使用Excel进行数据录入、整理及图表的绘制,采用SPSS 16.0软件进行统计和分析,用One-way ANOVA进行方差分析,并用Duncan检验法进行多重比较分析。

2.1 镁对艾纳香叶片内源激素GA3含量的影响

由图1可知,在处理第30 d和第90 d,与CK相比,其他3个施镁水平对艾纳香中GA3含量增加均有显著的促进作用(P<0.05)。在处理第30 d,与CK相比,1.5、15.0 和150.0 mg·mL−1镁处理GA3分别显著增加了31.82%、36.36%和42.71%。在处理第60 d和第120 d,各处理间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

图 1 不同施镁水平对艾纳香中赤霉素含量的影响Fig. 1 Effect of Mg applications on GA3 content of B. balsamifera

2.2 镁对艾纳香叶片内源激素IAA含量的影响

由图2可知,在整个处理过程中,镁元素极显著的增加了艾纳香中IAA含量(P<0.01)。在处理第30 d,与CK和1.5 mg·mL−1镁水平相比,15.0 、150.0 mg·mL−1施镁水平极显著增加了IAA含量,分别是CK和1.5 mg·mL−1镁处理组的2.56倍、1.45倍和2.40倍、1.36倍,1.5 mg·mL−1镁处理组是0.0 mg·mL−1镁处理组IAA含量的1.77倍(P<0.01)。

2.3 镁对艾纳香叶片内源激素ABA含量的影响

由图3可知,在处理的第30 d、60 d和第90 d,镁显著的增加了艾纳香中ABA含量(P<0.05)。在处理第30 d,与CK和1.5 mg·mL−1镁水平相比,15.0 mg·mL−1和150.0 mg·mL−1施镁水平极显著增加了ABA含量,分别是CK和1.5 mg·mL−1镁处理的1.4倍、1.25倍和1.32倍、1.18倍,1.5 mg·mL−1镁处理是CK组ABA含量的1.12倍(P<0.01)。在处理第120 d,各处理间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

图 2 不同施镁水平对艾纳香中生长激素含量的影响Fig. 2 Effect of Mg applications on IAA content of B. balsamifera

图 3 不同施镁水平对艾纳香中脱落酸含量的影响Fig. 3 Effect of Mg applications on ABA content of B. balsamifera

2.4 镁对艾纳香叶片内源激素ZR含量的影响

由图4可知,在处理的第30 d、60 d和第90 d,镁显著增加了艾纳香中ZR含量(P<0.05)。在处理第30 d,与CK和1.5 mg·mL−1镁水平相比,15.0 mg·mL−1和150.0 mg·mL−1施镁水平极显著增加了ZR含量,分别是CK和1.5 mg·mL−1镁处理组的2.46倍、1.39倍和2.42倍、1.37倍,1.5 mg·mL−1镁处理组是CK处理组ZR含量的1.76倍(P<0.01)。在处理第120 d,各处理间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

2.5 镁对艾纳香药材产量的影响

由图5可知,在艾纳香的生长期中,随着时间的延长,不同施镁水平下艾纳香药材产量整体呈现出逐渐升高的趋势。在处理第30 d,各处理间药材产量差异显著(P<0.05),1.5 mg·mL−1和15.0 mg·mL−1镁处理组药材产量显著高于CK组,分别增加了25.49%和25.08%。在处理第60 d和第90 d,各处理间药材产量差异极显著(P<0.01)。15.0 mg·mL−1镁处理组药材产量最高,显著高于其他3个处理组。

2.6 镁对艾纳香l-龙脑百分含量的影响

由图6可知,在艾纳香生长期,随着时间的延长,不同施镁水平下艾纳香有效成分l-龙脑含量整体表现为先升高再下降。根据方差分析结果表明,在处理第60 d和第90 d,各处理间差异极显著(P<0.01)。在处理第60 d,CK组l-龙脑百分含量最低,较1.5、15.0 和150.0 mg·mL−1镁处理组分别显著降低了34.37%、35.48%和25.00%。然而,在处理第90 d,1.5 mg·mL−1镁处理组l-龙脑百分含量显著高于其他处理组。在处理第30 d和第120 d,各处理间差异不具有统计学意义(P>0.05)。

图 4 不同施镁水平对艾纳香中玉米素含量的影响Fig. 4 Effect of Mg applications on ZT content of B. balsamifera

图 5 不同施镁水平对艾纳香药材产量的影响Fig. 5 Effect of Mg applications on medicinal material yield of B. balsamifera

图 6 不同施镁水平对艾纳香中l-龙脑百分含量的影响Fig. 6 Effect of Mg applications on l-borneol content of B. balsamifera

2.7 镁对艾纳香l-龙脑单株产量的影响

由图7可知,在艾纳香生长期,随着时间的延长,不同施镁水平下艾纳香中l-龙脑单株产量表现为逐渐上升。根据方差分析结果表明,各处理间差异极显著(P<0.01)。在处理第30 d、60 d和第120 d,与CK相比,其他3个施镁水平均显著提高了l-龙脑单株产量。在处理第90 d,1.5 mg·mL−1和15.0 mg·mL−1镁处理组l-龙脑单株产量显著高于0.0 mg·mL−1和150.0 mg·mL−1镁处理组,分别增加了41.44%、25.00%和44.96%、28.12%。

图 7 不同施镁水平对艾纳香中l-龙脑单株产量的影响Fig. 7 Effect of Mg applications on per plant l-borneol yield of B. balsamifera

3 讨论与结论

3.1 镁对艾纳香内源激素积累和产量的影响

内源激素对植物生长发育、产量和品质形成具有重要的调控作用。在植物生长发育的不同阶段都需要植物激素的参与调控,例如种子萌发、营养物质的转移和运输、果实发育成熟、植物衰老等不同阶段,氮等营养元素的施用可以对植物内源激素的代谢和平衡起到调节和促进的作用[17−19]。但是有关施镁对植物内源激素的影响相关报道较少。周开兵等[20]研究发现,在妃子笑荔枝果实生长发育中,施镁对IAA和Eth含量无明显的增加作用,但是显著增加了GA3、ABA含量以及ABA/GA3含量比。PeyamiBattal[21]研究发现,较对照组相比,过量氮、磷和镁处理的营养期玉米根、茎和叶中GA3含量增加了6%~27%,在开花期,GA3没有显著的增加,反而下降了8%~35%。Rehman H U,et al[22]证实玉米籽粒提取物(MGE)结合叶面喷施镁可以促进Hysun-336向日葵杂种中氮、磷、钾、镁吸收以及增加内源性植物激素IAA、GA3和玉米蛋白含量。本文研究结果证实,在艾纳香生长期,对艾纳香叶片喷施不同水平的镁,可以显著增加艾纳香叶片中内源激素GA3、IAA、ABA和ZT含量,与上述的研究结果一致,说明适量的施镁能促进与艾纳香叶片产量形成密切相关的内源激素含量的增加,进而显著提高艾纳香药材产量。这从内源激素生理角度阐述了适宜的镁处理能提高艾纳香药材产量的原因。

另一方面,由于镁是植物生长发育所必需的营养元素之一,施镁有利于植物叶绿素的形成和转化,镁素还可以参与植物光合作用,调节植物碳水化合物、脂肪、蛋白质和核酸等物质的合成和积累[23−25],可以更好地为植物提供良好的物质基础,以促进植物生长和发育[26]。这也佐证了本文研究结果,证实镁可以显著提高生长期艾纳香药材产量。在海南,艾纳香的生长期较长,从8月至11月生长都比较旺盛,11月到12月为采收期,此时的产量和质量均较高。以上结果与王丹等[9]在海南冬季外源施镁在艾纳香上的效果一致。这说明艾纳香生长的任何时期都需要镁素,促进生长发育,提高药材产量。目前,已有众多研究证实,施加镁可以促进太子参、槟榔等生长发育,提高产量[26−28]。

3.2 镁对艾纳香中l-龙脑积累的影响

次生代谢是植物生命活动过程中重要的过程,可以通过生物因素和非生物因素的诱导促进其大量形成。l-龙脑是艾纳香主要的萜类次生代谢产物,也是艾纳香重要的药用活性成分,提高l-龙脑含量对于艾纳香的药用价值和功效作用有着重要的意义[29]。镁不仅可以影响植物内源激素的变化和植物生长,而且对植物体内化学成分积累等次生代谢也有影响。本研究发现,不同施镁水平可以不同程度的提高艾纳香中l-龙脑百分含量和单株产量,尤其是1.5和15.0 mg·mL−1镁效果最好。这主要可能由于l-龙脑为单萜类化合物,其催化合成的第一个关键酶为单萜合酶,控制着异戊二烯转化为单萜化合物[2,30]。单萜合酶以单体或同型二聚体的形式催化反应。每个单体C端活性位点的天冬氨酸保守区DDxxD首先与一个二价金属阳离子(Mg2+)结合,然后与氢键络合形成H2O-Mg2+复合物和H2O形成基本空间结构,后续的焦磷酸基团(diphosphate,PPi)可以与Mg2+络合,诱导活性位点的α螺旋规则排列进行催化,并使香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate,GPP)离子化,才能发生异构、重排和环化反应[31−34]。由此可见镁主要通过影响单萜合酶在l-龙脑生物合成过程中的构成和催化活性,调控l-龙脑的次生代谢过程,最终影响l-龙脑的形成和积累。

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