液体活检在妇科恶性肿瘤中的研究和应用

丁予露，刘 洋，周红林

妇科恶性肿瘤是严重影响女性生活和生命质量的疾病，现阶段缺乏早期诊断技术及有效的治疗。临床应用最多的是组织活检，但因其取材局限，无法获取肿瘤的基因组全貌，甚至可能引起肿瘤的扩散，因此其应用受到了局限。液体活检作为一种新的无创检测技术，是以血液、尿液、腹水等体液为检测内容，作为一种非侵入性肿瘤来源材料，其应用前景更广泛，主要由循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、循环肿瘤微RNA(microRNA, miRNA)蛋白质和外泌体等组成[1]，具有无创、简便、实时监测、可重复取材等优势。与传统的组织活检相比，可实现对肿瘤进行实时监测，以便实时了解肿瘤分子结构异质性，比现有的临床成像技术更准确，实现个体化精准治疗[2]。

1 循环肿瘤细胞与ctDNA的特点

1.1 循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞研究被认为是液体活检领域的新起点，是一种在原发性肿瘤形成和生长的早期被释放到体液中的肿瘤细胞[3]。循环肿瘤细胞已被证实为转移性乳腺癌和其他实体肿瘤(如前列腺癌、结直肠癌和肺癌)的预后标志物，在预后评估方面比传统影像学方法具有更高的准确性，利用循环肿瘤细胞可监测并早期发现患者的微小残留病变。另一方面，循环肿瘤细胞的分子特征对于指导药物靶向治疗的选择具有重要意义，能提供不同分子靶点的动态变化。研究证实，循环肿瘤细胞的定性和定量分析已成功地应用于肿瘤的进展、预后、诊断和反应的评估及个性化治疗[4]。

1.2 ctDNA循环游离DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)是由体液中存在的肿瘤细胞或凋亡细胞释放的细胞外DNA。cfDNA的发现可以追溯到1948年，Mandel和Metais首次报道健康人血液中存在cfDNA。30年后，在转移性癌患者中发现cfDNA水平明显高于非转移性癌，而且cfDNA水平的下降与治疗反应有关[5]。ctDNA主要来源于外周循环肿瘤细胞，是cfDNA的一个微小亚群，ctDNA可评估肿瘤的异质性，实时监测肿瘤的突变性，具有较高的诊断和预后价值，并能识别肿瘤的存在。ctDNA的检测方法具有高灵敏度和特异性。研究表明[6]，ctDNA可能是药物开发和研究肿瘤(如乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌)在体内异质性和克隆进化的监测手段。ctDNA可以作为预测预后、实时监测治疗反应和克服耐药性的潜在生物学标志物。

2 液体活检与妇科恶性肿瘤

2.1 液体活检与卵巢癌卵巢位于盆腔深处，卵巢癌早期无明显临床症状，易发生盆腔种植及早期转移，恶性程度高，预后差，3/4的卵巢癌是在肿瘤扩散到腹部时才被诊断。在过去30年中，人们尝试多种方法提高卵巢癌的早期诊断，但其生存率无明显改善。CA125是卵巢癌中常用的生物学标志物，但一些非恶性肿瘤也可引起血清CA125浓度的增加。因此，早期发现新的标志物、提高分子生物学技术、更好的创新治疗方案和预测的需求已经十分迫切。过去卵巢癌治疗方法主要是手术切除肿瘤病灶，然后进行标准的辅助化疗，多采用铂类和紫杉醇联合治疗。然而在半数以上的病例中，出现了化疗耐受和肿瘤复发。新的治疗概念包括在某些临床情况下应用贝伐珠单抗等靶向治疗，可与标准化疗方案联合应用[7]。液体活检对于提高卵巢癌的早期诊断、监测肿瘤复发、降低患者病死率等方面具有重要意义，为卵巢癌提供新的研究方向。

2.1.1循环肿瘤细胞与卵巢癌 循环肿瘤细胞参与卵巢癌血源性转移途径，早期在外周循环中即可检测出循环肿瘤细胞。虽然在实体恶性肿瘤中，循环肿瘤细胞含量少，而且在大多数情况下，可用的外周血样本数量有限。但经过不同的循环肿瘤细胞检测、计数和分子表征分析系统的发展，扩大了液体活检领域，为患者提供关于肿瘤转移复发和治疗效果的监测。研究表明[8]循环肿瘤细胞可作为卵巢癌早期诊断的生物学标志物，对早期卵巢癌的诊断敏感性为41.2%，特异度为95.1%，阳性预测值为77.8%。目前血清CA125水平仍被认为是监测卵巢上皮性癌化疗反应和预测预后最有价值的检测指标。然而，最近Pearl等[9]在31例接受标准紫杉醇和卡铂联合化疗方案的患者中对循环肿瘤细胞的连续计数预测了治疗反应性。在他们的研究中，循环肿瘤细胞在预测肿瘤进展或复发方面比CA125更敏感，能够提前预测疾病变化情况。Fan等[10]首先报道循环肿瘤细胞在原发性卵巢癌中的预后意义，他们发现循环肿瘤细胞水平与病程进展相关，因此可用于病情监测和疗效评估。Kolostova等[11]进行体外循环肿瘤细胞培养和细胞形态学分析，最后利用PCR进行基因表达研究，对循环肿瘤细胞分子进行标记，他们发现循环肿瘤细胞的存在与患者临床病理特征可能存在一定的联系，主要是与CA125状态相关，在此基础上，提出新的独立预后标志物。他们还认为，血源性转移途径以循环肿瘤细胞为代表，CA125水平升高提示淋巴细胞转移。传统上认为卵巢癌主要是直接蔓延及腹腔种植转移，这使得循环肿瘤细胞在外周循环中的阳性检出率较低。然而，最近的研究发现[12]，外周血循环中循环肿瘤细胞失去部分上皮特征性分子，即发生上皮-间充质转换，用于检测循环肿瘤细胞的大多数分析系统是基于上皮标志物的表达，而目前常用的技术还无法检测出间充质标记的循环肿瘤细胞亚型，因此在不使用上皮标志物的情况下分离和检测可提高循环肿瘤细胞的检出率。

2.1.2ctDNA与卵巢癌 ctDNA具有肿瘤特异性突变、DNA甲基化等分子生物特性改变。卵巢癌患者ctDNA浓度明显增加，是一种非常具有前途的无创诊断、预后和预测的生物学标志物，因此其可以直接获取原发肿瘤的DNA信息并实时监测肿瘤的异质特性。此外，卵巢癌中cfDNA水平升高，通过早期检测cfDNA水平可以实现对肿瘤的早期诊断。Steffensen等[13]利用实时荧光定量PCR法检测144例多重耐药卵巢癌患者的血浆cfDNA水平，这些患者接受贝伐珠单抗治疗；在单变量和多变量生存分析显示，cfDNA水平与无进展生存期(progression-free survival, PFS)(P=0.000 4)和总生存期(overall survival, OS)有关(P=0.005)。因此，Steffensen等[13]认为对于接受贝伐珠单抗治疗的铂类耐药卵巢癌患者血浆cfDNA是一个独立的预后因素。过去CA125被认为是诊断卵巢癌的主要标志物，绝大多数基于蛋白质的肿瘤标志物不仅由癌细胞产生，也可由非肿瘤或炎性细胞产生，因此良性或炎症过程可导致血清CA125异常升高。近年从肿瘤细胞中分离出来的DNA生物学标志物在监测治疗反应和预测预后方面显示出巨大应用前景。表观遗传学改变在癌症的发生、进展中起重要作用，而异常的DNA甲基化模式的特征在于启动子的高甲基化。DNA甲基化的改变：(1)癌症发生的早期事件；(2)比体细胞突变更常见；(3)以特定区域为中心，即CpG岛。随着其化学和生物稳定性，检测血清或血浆中异常的DNA甲基化提供新的癌症诊断策略。DNA甲基化检测可作为癌症存在的高度特异性信号，并可能指导个性化治疗[14]。

2.2 液体活检与子宫内膜癌子宫内膜癌近年来发病率逐渐上升，主要发生于绝经后的妇女，仅14%患者发生于绝经前妇女，40岁以下发病率仅为5%。然而，30%的患者确诊时已为晚期，5年生存率急剧下降。子宫内膜癌主要是根据绝经后阴道异常流血，结合超声影像学检查行早期诊断，超声检查虽然具有较高的敏感性(98%)，但缺乏特异性(35%)[15]。目前子宫内膜活检为诊断金标准。然而，由于无法获取充分的样本或组织学检查，其应用具有一定的限制性。子宫内膜癌分为雌激素依赖型子宫内膜样癌和非子宫内膜样癌，其在分子、组织病理学特征上存在差异，该分类决定了手术的范围及随后辅助治疗的选择，然而子宫内膜癌组织学多样性相关的分子异质性，使目前治疗方案不够个性化[16]。使用液体活检诊断和标记子宫内膜癌，可以促进肿瘤异质性在治疗选择和监测中的整合。寻找与子宫内膜癌晚期复发和治疗反应相关的新分子靶点和生物学标志物，是子宫内膜癌晚期治疗面临的主要临床挑战之一。目前液体活检领域已被认为是实现个性化医疗的途径，其对子宫内膜癌的早期诊断、肿瘤表型、治疗选择和疾病实时监测等方面发挥重要作用。

2.2.1循环肿瘤细胞与子宫内膜癌 研究发现[17]晚期子宫内膜癌组织中可检测到循环肿瘤细胞，虽然血液中循环肿瘤细胞的检测可能有助于确定子宫内膜癌患者复发的潜在风险，评估预后并指导术后治疗，但目前尚缺乏理论支持，因此限制了其在临床中的应用。Obermayr等[12]利用6个基因(CCNE2、DKFZp762E1312、EMP2、MAL2、PPIC、SLC6A8)进行多标记分析，检测25例子宫内膜癌患者的循环肿瘤细胞阳性检出率为64%。重要的是，基因表达谱具有很强的循环肿瘤细胞可塑性表型，具有上皮-间充质转化特征，这可能为循环肿瘤细胞的转移传播和归巢提供优势。此外，发现CTNNB1、STS、GDF15、RELA、RUNX1、BRAF和PIK3CA可能成为潜在的治疗靶点。研究发现[18]循环肿瘤细胞与血清CA125/HE4无明确的相关性，标准化疗第1周期后未检测到循环肿瘤细胞。在与循环肿瘤细胞相关的生物学标志物中，甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1, TTF-1)的表达与TNM分期、血管浸润和淋巴结转移相关。与TTF-1阴性组相比，TTF-1阳性组PFS和OS降低。TTF-1阳性组复发率升高。

2.2.2ctDNA与子宫内膜癌 cfDNA水平的变化与子宫内膜癌的发生、发展有关。cfDNA在子宫内膜癌中作为预测预后和选择个体化治疗方案的标志物具有一定的价值，但其临床应用受到一定限制，应通过影像学检查及诊断性刮宫或子宫内膜抽吸活检提高早期诊断率。Dobrzycka等[19]发现血浆中TP53突变经常发生在早期浆液性癌中，可实现早期监测，降低肿瘤细胞浸润和腹腔、淋巴结及远处转移风险。另外，ctDNA检测可以发现残留病变的存在。此外，相对于目前使用的血清和影像学研究，ctDNA可以动态预测治疗的反应。ctDNA是一个独立的生存预测因子，可以早期发现疾病的持续存在及复发情况，以及通过ctDNA的监测可能会提高子宫内膜癌患者的生存率和生活质量。表观遗传标记在识别不同肿瘤方面也显示巨大的潜力，许多基因的甲基化状态已经被认为是癌症检测的精确工具[20]。

3 结语

液体活检技术为妇科肿瘤学的精准治疗提供了新的发展方向，有助于早期诊断、监测肿瘤复发、个性化治疗的选择和治疗耐药性评估。但液体活检的应用有一定的局限性，血液循环中肿瘤物质的含量较低，目前缺乏标准的方法用于分离和检测，其临床应用需要多阶段发展过程，在临床常规应用液体活检技术之前，对所使用的检测方法需要行进一步的检验、标准化和质量控制。随着检测技术的进步和优化，液体活检为妇科肿瘤学的发展开辟了新的研究领域，相信在未来妇科肿瘤研究中将发挥更大的作用。