芪蛭胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬相关因子PI3K、Beclin-1表达水平的影响

蒋希成，段芳芳，张婷婷，孙晓伟，姜国华，王兵，张浩，孙远征，姜德友*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是指脑组织缺血又重新获得血流灌注后，对脑组织产生的进一步损伤作用，是脑梗死常见的病理生理过程。自噬是一种细胞的自我修复整合机制，通过“自食”，清除受损细胞器，为细胞的修复提供物质基础和能量基础，在缺血缺氧诱导时，作为细胞应答而被激活，为机体提供氨基酸和脂肪酸来维持细胞代谢及ATP水平，维持机体运行[1]。多条信号通路参与自噬的调控，其中PI3K-Akt-mTOR信号通路研究最为深入，在自噬调控中扮演核心角色，具有抗炎、抗氧化应激、神经保护等多种积极作用[2]，抑制该通路中关键蛋白将阻断该通路，从而激活自噬。当今人们大多处于久坐、缺乏运动、熬夜、饮食以肥甘较多、工作压力大的背景条件下，气虚血瘀又痰湿偏胜的体质不断增加，课题组以益气活血通络为法创立的芪蛭胶囊，在治疗缺血性脑中风病的临床应用中获得佳效[3]。在前期基础上，本研究选择MCAO/R模型，观测PI3K-Akt-mTOR信号通路中关键蛋白PI3K，Beclin-1，探讨芪蛭胶囊对CIRI的拮抗作用及分子机制。

1 材料

1.1 动物

健康SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠60只，6～8周龄，体质量(200±20)g，购置于辽宁长生生物技术有限公司(许可证编号：SCXK(辽)2015-0001)，保持实验室内湿度维持45%～55%，温度维持(22±1)℃，室内光线明暗循环为12 h/12 h，自由进食及饮水，实验前适应性饲养1周。

1.2 药物

芪蛭胶囊由黄芪、烫水蛭、丹参、地龙、石菖蒲、郁金、当归、川芎等组成，药材均购自黑龙江中医药大学附属第一医院，生产于黑龙江德顺长中药饮片有限公司。依据临床等效剂量，根据人和大鼠体表面积折算用药量，文火煎煮，旋转蒸发浓缩至生药含量为1.27 g/mL的药液，密封，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

主要试剂包括：3-MA(批号：M129496，阿拉丁)；rapamycin(批号S115842，阿拉丁)；LY294002(批号HY-10108，MCE)；PBS(批号：P10033，双螺旋)；TTC(批号：A610558-0005，生工)；Western及IP细胞裂解液(批号：P0013，beyotime)；PMSF(批号：ST506，beyotime)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0011，beyotime)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(批号：P0015，beyotime)；BSA(批号：BS043，Biosharp)；山羊抗兔IgG(批号：A0208，beyotime)；ECL发光液(批号：P0018，beyotime)；内参抗体β-actin(批号：sc-47778，santa cruz)；Beclin-1(批号：11306-1-AP，Proteintech)；PI3K p85(批号：A11177，ABclona)；p-PI3K p85(批号：AF3241，Affinty)等。主要仪器设备包括：ALC-H型脑立体定位仪(上海奥尔科特生物科技)；台式牙钻机(中国上海齿科医械厂)；微量注射器(镇江康利医疗器械有限公司)；DW HL-668型超低温冰箱(中科美菱)；水浴锅(余姚市东方电工仪器厂)；电泳仪(型号：DYY-7C，北京六一)；双垂直蛋白电泳仪(型号：DYCZ-24DN，北京六一)；凝胶成像系统(型号：WD-9413B型，北京六一)；超速冷冻离心机(型号：H-2050R，湖南湘仪)；水平摇床(型号：WD-9405B，北京六一)；酶标仪(型号：ELX-800，BIOTEK)等。

2 方法

2.1 分组及给药

健康雄性SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只。A组：sham组；B组：模型组；C组：3-MA组(于造模前24 h在缺血侧前囟点右侧旁开1.4 mm，向后0.8 mm处，用牙科钻打孔，用微量注射器抽取3-MA溶液10 μL(3 μg/μL)注入侧脑室，注射5 min，留针5 min。)；D组：雷帕霉素组(造模前30 min腹腔注射雷帕霉素溶液10 mg/(kg·d)，取材前2.5 h再注射1次)；E组：LY294002组(腹腔注射LY294002溶液，方法用量同D组)；F组：中药组。其中5只做TTC染色，5只做Western-Blot。ABCDE组于造模前连续7 d生理盐水灌胃2.5 mL/d，F组同步连续7 d中药灌胃2.5 mL/d。

2.2 模型复制

采用改进线栓法[4]复制大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。将大鼠麻醉(按0.3 mL/100 g体质量，腹腔注射2%戊巴比妥钠)，仰卧位固定，于颈部正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，切勿损伤血管及迷走神经。结扎CCA及ECA，顺CCA经ICA将栓线送至颅内18 mm左右，阻断大脑中动脉(MCA)血流，切记稍有阻力即停止进栓，避免蛛网膜下腔出血，缝合切口，留置线栓头于体外。缺血2 h后行再灌注，抽提栓线至CCA内即可，通过Willis环侧支循环实现再灌注(再灌注24 h)。Sham组只分离血管，不进行模型复制。

2.3 NSS评分

NSS(Neurological Severity Score)评分用于评价大鼠脑缺血再灌注24 h后神经功能损伤情况。得分由运动、感觉、平衡木及反射四项测试综合评定，范围0～18分，重度损伤：13～18分，中度损伤：7～12分，轻度损伤：1～6分。

2.4 TTC染色

将各组用于TTC染色的大鼠于冰盒上断头取脑，将脑组织于-20 ℃冰箱冷冻1 h。取出后，在冰盒上用刀片去除绣球和小脑，将大脑平均切成2 mm左右厚的5个薄片。将薄片放入PBS配制的0.4%TTC染液中，避光37 ℃染色10～15 min，翻动切片使其均匀着色。取出后按顺序摆放，拍摄照片。

2.5 Western blot法检测大脑组织PI3K，p-PI3K，Beclin-1蛋白表达水平

将再灌注24 h后冻存于-80 ℃的脑组织取出，研磨，加入含有1 mmol/L PMSF的Western及IP细胞裂解液进行裂解，低温冷冻离心机11 000 r/min，4 ℃，离心5 min，取上清即大脑组织总蛋白样品，用BCA 反应进行蛋白定量。5×Loading Buffer和PBS稀释蛋白样品，于沸水浴中煮沸5 min使蛋白充分变性。经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转印于PVDF膜上，TBST缓冲液洗5 min，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h(p-PI3K的封闭液、一抗孵育液、二抗孵育液为3 %BSA溶液)，分别加入一抗(Beclin-1稀释比例1∶1 000，PI3Kp85稀释比例1∶1 000，p-PI3Kp85稀释比例1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日TBST漂洗5 min×4次，加入二抗(羊抗兔IgG-HRP稀释比例1∶5 000)37 ℃孵育45 min，TBST漂洗5 min×6次。ECL化学发光试剂反应后，于暗室曝光。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 芪蛭胶囊对NSS神经功能评分的影响

与sham组比较，其余组均出现神经功能损伤症状，评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，雷帕霉素组、LY294002组、中药组神经功能损伤症状改善，评分显著降低(P<0.05)；与中药组比较，LY294002组神经功能损伤较重(P<0.05)。分析可知，芪蛭胶囊对CIRI大鼠的神经功能起治疗及保护作用，见表1。

表1 各组大鼠NSS神经功能评分情况

3.2 芪蛭胶囊对脑组织梗死体积百分比的影响

TTC染色后，使用Image-Pro Plus Analysis Software计算机图像分析系统计算脑梗死体积，见图1，表2。与sham组比较，其余组均出现明显梗死灶(P<0.05)；与模型组比较，3-MA组、LY294002组脑梗加重，梗死体积进一步扩大(P<0.05)，同样与模型组比较，雷帕霉素组、中药组脑梗死减轻，梗死灶显著缩小(P<0.05)；与中药组比较，雷帕霉素组对CIRI大鼠的脑保护作用较弱，梗死体积较大(P<0.05)。对比分析可知，芪蛭胶囊可有效减轻CIRI大鼠脑梗死程度。

图1 各组大鼠脑梗死面积比较

表2 各组大鼠脑梗死面积

3.3 芪蛭胶囊对大鼠脑组织Beclin-1，p-PI3K，PI3K蛋白表达的影响

将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。①Beclin-1：与sham组比较，其余组Beclin-1表达均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，3-MA组Beclin-1表达显著降低(P<0.05)，雷帕霉素组、中药组Beclin-1表达显著升高(P<0.05)，见图2，表3。②p-PI3K：与sham组比较，模型组、雷帕霉素组、LY294002组、中药组p-PI3K表达显著降低(P<0.05)；与模型组比较，LY294002组、中药组p-PI3K表达进一步降低(P<0.05)，见图3，表3。③PI3K：与sham组比较，模型组、中药组PI3K表达显著降低(P<0.05)；与模型组比较，3-MA组PI3K表达显著升高(P<0.05)。见图3，表3。可知，芪蛭胶囊可降低p-PI3K的表达，使Beclin-1高表达，从而进一步激活自噬。

注：A：sham组；B：模型组；C：3-MA组；D：雷帕霉素组；E：LY294002组；F：中药组。图2 Western blot法检测各组脑组织Beclin-1蛋白表达比较

表3 各组脑组织PI3K、p-PI3K、Beclin-1蛋白表达的变化

4 讨论

中风[5]之名首载于仲景《金匮要略·中风历节病脉证并治第五》：“脉微而数，中风使然。”仲景认为中风病以正虚为本[6]因气血不足，外邪诱发而致病，后清代医家王清任提出“气虚致瘀”的观点，并且创立中风病传世名方“补阳还五汤”，临床效如桴鼓[7-8]。我课题组在总结梳理前人的经验基础上观察研究临床病例，认为本病的病因病机在临床中以“气虚血瘀夹痰”较为常见，气虚为本，血瘀痰浊为标，血瘀痰浊痹阻脑络而为病，拟定芪蛭胶囊经验方剂。该方由黄芪、烫水蛭、丹参、地龙、石菖蒲、郁金、当归等药物组成，方中重用黄芪为君，补气实表，逐邪祛风，治疗中风，恰合本病“气虚”之病机；针对本病“血瘀”的核心病机，伍用水蛭逐恶、逐瘀、破血、通络，同样取地龙破血逐瘀，通经活络之效，丹参补血活血兼可祛瘀；石菖蒲、郁金二味，豁痰开窍配合活血化瘀之味，乃痰瘀同治之意，正对本病“夹痰”之病机。我课题组前期实验研究发现[3,9-10]，该方能减轻脑水肿；保护脑组织神经元内线粒体形态及功能；提高脑组织SOD活性，减少MDA和NO的生成，清除过量自由基，对脑组织具有保护作用；可通过下调I/R大鼠脑组织PKC-MARCKS信号通路中MARCKS蛋白及mRNA的高表达，缓解CIRI。

近年来，自噬在脑缺血再灌注中发挥的重要作用逐步被认知。本次研究发现，使用自噬抑制剂3-MA[11]后相比模型组大鼠神经功能受损加重，脑梗死区域变大，说明自噬的发生对CIRI起拮抗作用。除抑制自噬外，本研究设雷帕霉素、LY294002组，分别抑制通路关键蛋白mTOR、PI3K从而激活细胞自噬，结果显示，雷帕霉素进一步激活自噬可有效降低CIRI大鼠神经功能评分，对脑组织具有显著保护作用，梗死体积显著缩小，而LY294002组则未起到治疗作用，究其原因，PI3K-Akt-mTOR信号通路并非线性存在，而是同时存在多种交叉对话及反馈机制[12]，抑制上游PI3K活性影响较大，自噬被过度激活，或可对实验结果造成影响[12]，加重CIRI。相比之下，中药组进一步适度激活自噬，在神经功能和脑组织保护方面均获佳效。总之，自噬在I/R中发挥着双向调节作用，适度自噬可保护缺血缺氧的脑组织，不足或过度的自噬则不能达到理想疗效或进一步导致脑组织坏死[13-14]。

PI3K-Akt-mTOR信号通路是自噬经典通路，其中PI3K、Beclin-1是脑缺血再灌注损伤研究的常用指标，在自噬发生过程中不可或缺，对二者进行研究可进一步掌握自噬发生规律，更好应用自噬的双向调节作用。Ⅰ型PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110构成的异源二聚体，PI3K静息状态下普遍存在于细胞质中[12]，其磷酸化形式p-PI3K被抑制，PI3K-Akt-mTOR信号通路被阻断，则自噬被激活[15]。Beclin-1是哺乳动物自噬的特异性基因，是自噬效应的标志[16]，自噬前体和自噬体形成的必需分子[17]，自噬发生时其呈高表达，脑缺血后6 h即可增多，24 h达高峰，且至少持续48 h，是脑缺血再灌注损伤的重要指标[18]。本研究结果显示，p-PI3K在I/R大鼠脑组织中表达降低，自噬激活，中药组p-PI3K表达进一步显著降低，说明自噬被进一步激活；同样，Beclin-1在造模后表达增加，其表达量在中药组最高，提示自噬被较大程度的激活。结合Western-blot结果与NSS评分及TTC染色结果，可知PI3K-Akt-mTOR信号通路介导的细胞自噬在CIRI中发挥重要调控作用，而芪蛭胶囊可调控PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白的表达，从而发挥拮抗CIRI的作用，有效保护缺血缺氧的脑组织细胞。

本研究进一步证实了芪蛭胶囊对CIRI的拮抗作用，通过对PI3K及Beclin-1在脑细胞表达情况的研究，明确了自噬在大鼠脑缺血再灌注中发挥的作用，且揭示了PI3K-Akt-mTOR信号通路关键蛋白PI3K对MCAO/R大鼠脑细胞自噬的调控作用，阐明了芪蛭胶囊拮抗CIRI的分子机制，为今后该病的防治及新药的研发提供新靶点和新思路。