清热除湿凝胶对SiHa细胞荷瘤鼠的抑瘤作用及对Bcl-2、Bax蛋白的影响

马秀丽，刘君，李家琦，薛晓鸥*

(1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100006；3.首都医科大学附属北京中医医院顺义院区，北京 101300)

宫颈癌(Cervical cancer，CC)是目前全球范围内威胁女性生命健康全球范围内威胁女性健康的第四大恶性肿瘤[1]，目前已经证实宫颈高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papillomavirus，HR-HPV)感染是引起宫颈病变甚至发展为宫颈癌的主要原因，其中16和18两型与CC的发生更为密切[2]。从HR-HPV感染到宫颈病变甚至癌变的机制仍不十分明确，有效防治HR-HPV感染是预防CC发生的关键环节和研究热点。本课题组在前期研究的基础上对清热除湿凝胶抑制HR-HPV复制从而抑制肿瘤发生发展的作用进行进一步探索。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级4～5周龄雌性BALB/c裸鼠50只，体质量(15±1)g，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司(SCXK京2016-0006)，饲养于北京中医药大学动物实验中心(温度：23～25℃，湿度：49%～51%)。实验经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准，批准编号：BUCM-4-2019041002-2041。

1.2 药品及试剂

清热除湿凝胶(百川飞虹技术有限公司)，注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)，重组Anti-Bax、Anti-Bcl-2抗体(美国Abcam公司)，生物素标记山羊抗兔(北京碧云天生物技术有限责任公司),抗体稀释液、DAB显色液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

1.3 实验仪器

细胞培养箱(Thermo公司)，生物安全柜(ESCO公司)，倒置相差显微镜(Motic公司)，离心机(Sigma公司)，高精度电子称重天平(英衡公司),游标卡尺(得力公司)，显微镜(麦克奥迪实业集团公司)。

2 方法

2.1 宫颈癌SiHa细胞悬液制备

宫颈癌SiHa细胞株复苏后进行培养、扩增，培养条件是培养条件是10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的MEM(EBSS)培养液，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。取对数生长期的SiHa细胞，常规消化，用MEM(EBSS)培养基重悬清洗，离心，2遍，计数，调整细胞悬液浓度为2×107/mL，放置于冰上转运，备用。

2.2 造模与分组

雌性5周龄裸小鼠，2×107/mL细胞悬液充分混匀，用1 mL注射器抽取细胞悬液，将细胞悬液注入裸小鼠右前腿外上方皮下，0.2 mL/只。细胞悬液注入后可见以注射部位为中心的圆形隆起，每日观察记录注射区域变化，以注射部位出现平均直径≥0.5 cm质硬肿物为造模成功。造模成功后按肿瘤体积大小，用随机数字法将荷瘤小鼠分为5组，每组10只，开始干预。

2.3 各组给药方法

模型组：常规饲养；卡波姆940组：卡波姆940(外涂,0.15 mL/50 mm3/d)；中药组：清热除湿凝胶(外涂,0.3 mL/50 mm3/d)；顺铂组：顺铂注射液(腹腔注射,0.2 mL/10 g/3 d)；联合用药组：清热除湿凝胶(外涂,0.3 mL/50 mm3/d)+顺铂注射液(腹腔注射,0.2 mL/10 g/3 d)，共给药28 d。

2.4 观察指标

观察不同组别荷瘤小鼠精神状态，饮食、摄水及体质量变化，干预第7、14、21、28天用游标卡尺测量荷瘤小鼠体表肿瘤长径(a)及短径(b)，计算肿瘤体积，肿瘤体积(V)=ab2/2，观察肿瘤生长趋势。HE染色观察肿瘤组织病理形态。免疫组化法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达情况。具体步骤参照说明书操作。

2.5 结果判定标准

在显微镜下观察每张切片(200×)，以细胞质或者细胞核内出现棕黄色颗粒为Bax及Bcl-2阳性细胞，取5个互不重复的视野进行拍照，应用Image-proplus软件图片进行分析，取5个视野的平均值进行统计分析。

2.6 统计方法

3 结果

3.1 一般情况观察

造模后，裸小鼠精神状态良好，干预后顺铂组和联合用药组与其它三组比较，在给药第二周起逐渐出现不同程度饮食、摄水量减少，体质量生长缓慢甚至负增长，部分荷瘤小鼠消瘦、脊柱及肋骨清晰可见，顺铂组更为明显，顺铂组与联合用药组分别于干预第20天，第27天死亡一只，死亡前荷瘤小鼠均出现体质量明显负增长，对其进行解剖，心脏、肺、肝、肾等脏器未见明显异常，考虑为顺铂毒副作用及体质量过低所致，其余各组一般状况良好。见表1。

表1 各时间节点荷瘤小鼠体质量变化情况

3.2 肿瘤生长情况

用药干预后，中药组、顺铂组、联合用药组与模型组比较肿瘤生长均受到抑制(P<0.05)；联合用药组、顺铂组与模型组、中药组比较，用药第7天肿瘤体积减小(P<0.05)，联合用药组抑制肿瘤生长速度较顺铂组在用药第14天出现优势(P<0.05)；中药组与模型组、卡波姆940组比较在用药7 d后肿瘤生长趋势略减缓(P>0.05)，第14天肿瘤体积明显减小(P<0.05)；卡波姆940组与模型组比较，肿瘤体积无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各时间节点荷瘤小鼠肿瘤生长情况

3.3 肿瘤组织病理学观察

荷瘤小鼠肿瘤组织呈圆形或椭圆形生长，模型组、卡波姆940组荷瘤小鼠肿瘤组织可见明显结节，质偏硬，活动度可，同时上述两组肿瘤组织周围可见明显血管生成，血运较其它组明显。解剖见各组肿瘤组织包膜完整，与周围组织边界清楚，无粘连，易剥离，组织切面呈鱼肉样，部分肿瘤组织切面中心位置可见液性坏死。镜下见，各组肿瘤组织细胞排列紊乱、拥挤，无极性，细胞大小、形态各异，细胞核增大，核质比例显著增大，核形不规则，染色较深，核分裂相多见。与模型组、卡波姆940相比，各用药组均可见不同程度细胞坏死形成的炎性反应细胞聚集区域，成片状分布。见图1。

注：A1、A2模型组，B1、B2卡波姆940组，C1、C2中药组，D1、D2顺铂组，E1、E2联合用药组。图1 各组肿瘤组织HE染色图

3.4 清热除湿凝胶对Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达的影响

由表3可知，中药组、顺铂组、联合用药组与模型组、卡波姆940组比较Bcl-2均降低，Bax均升高，以联合用药组表现最明显(P<0.05)；卡波姆940组与模型组比较无明显差异(P>0.05)。提示清热除湿凝胶有下调Bcl-2蛋白，上调Bax蛋白表达的作用，见图2～3。

表3 药物干预后肿瘤组织Bcl-2和Bax蛋白表达情况

注：A模型组，B卡波姆940组，C中药组，D顺铂组，E联合用药组。图2 各组肿瘤组织免疫组化Bcl-2染色图(200×)

注：A模型组，B卡波姆940组，C中药组，D顺铂组，E联合用药组。图3 各组肿瘤组织免疫组化Bax染色图(200×)

4 讨论

HR-HPV持续感染是导致宫颈癌的主要原因，治疗HR-HPV持续感染状态逆转其引起的宫颈病变级别是预防宫颈癌发生的关键[3]，而HPV病毒本身的种属特异性及嗜上皮特性目前难以离体培养进行研究，故选用HR-HPV16阳性SiHa细胞构建宫颈癌荷瘤小鼠模型用于后续研究。中医学中无宫颈HPV感染及宫颈癌的记载，根据其带下量多或夹脓血、异味等临床表现归属于带下病范畴。“清热除湿凝胶”源于我国名老中医郭志强教授治疗湿热下注型带下病、宫颈炎的散剂经验方划裁而来，临床应用中发现其有治疗HPV感染的作用。后经过薛晓鸥教授团队对处方和剂型进行改革后加入基质卡波姆940而成凝胶剂，具有较好的黏附性，使用方便，作用持久等优点。组方主要药物包括紫草、金银花、莪术、苦参、黄柏、白及、百部、冰片、儿茶等。君药紫草清热解毒、凉血活血；臣药金银花、莪术、苦参、黄柏清热燥湿，泻火解毒，杀虫止痒，活血祛瘀；佐药白及、百部、冰片，收涩止痒，止痛防腐，敛疮生肌；使药儿茶生肌祛湿。君臣相须为用，主症与兼症并顾，佐使药各司其职，使药效所到之处湿得清，热得除，毒得解，带下自止，创面收敛愈合，阴痒等不适症状缓解，全方共奏清热除湿止带、杀虫止痒敛疮。团队在前期已经对其抑瘤作用进行了初步探索，体外实验研究表明，清热除湿凝胶可抑制人宫颈癌Siha增殖，并诱导其凋亡，进一步体内实验发现，其对Siha细胞荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显抑制作用，其作用机制可能与下调致癌蛋白E6/E7的表达，磷酸化ERK/P38 MARK信号转导通路有关[4-6]。

肿瘤性疾病的发生是细胞凋亡机制放松调节的一个标志，使部分异常或衰老细胞发生免疫逃逸，进入无限增殖状态，细胞凋亡的改变不仅与肿瘤的发生、发展有关，同时与近年来发生的肿瘤治疗的耐药性有关[7]，Bcl-2家族成员是线粒体凋亡途径的重要调控者[8]，根据其功能不同可分为抗凋亡蛋白家族和促凋亡蛋白家族，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白家族的主要代表成员，Bax是促凋亡蛋白家族主要代表蛋白之一[9]。研究表明，Bcl-2蛋白在诸多肿瘤细胞中高表达，且是线粒体凋亡突降的主要抗凋亡蛋白，在肿瘤细胞的凋亡调控中发挥着重要作用[10]。Bcl-2/Bax比值变化可影响其下游因子的表达,影响线粒体通路是否正常发挥作用[11]。近年来，中医药在肿瘤性疾病促凋亡及耐药性方面研究越来越多，中药治疗肿瘤性疾病是当今医学研究热点之一。

本研究通过荷瘤小鼠模型观察清热除湿凝胶对宫颈癌的抑制作用及机制，结果发现清热除湿凝胶在给药一周后肿瘤生长速度较模型组及卡波姆940组生长速度减缓，用药第二周肿瘤生长趋势明显减缓，随着用药时间的延长，肿瘤抑制作用明显，同时用药期间荷瘤小鼠日常精神状态可，活动自如，饮食、摄水情况尚可，体质量增长平缓，无明显体质量下降情况未发生死亡，提示其在抑瘤的同时可保证荷瘤小鼠的生活质量。当清热除湿凝胶与顺铂联合应用时抑瘤效果更明显。通过对Bcl-2、Bax蛋白检测发现，清热除湿凝胶可下调Bcl-2蛋白表达的同时上调Bax蛋白表达，Bcl-2、Bax蛋白表达关系发生变化，从而影响下游相关蛋白表达可能是其抑制肿瘤生长的机制之一。这与文献报道一些清热除湿中药在抑瘤作用方面对Bcl-2和Bax调节作用相符[12-14]。本研究证实清热除湿凝胶能够抑制裸鼠HR-HPV16阳性SiHa细胞移植瘤的增殖，并且部分作用机理可能与药物改变了癌症相关蛋白Bcl-2和Bax的表达有关。为中医药防治HPV感染导致肿瘤奠定研究基础。