罗非鱼头磷脂对RANKL诱导RAW264.7细胞分化的抑制作用及其对破骨细胞凋亡作用的机理

马 婷，夏光华，李 川，申铉日*

（海南大学食品学院，海南 海口 570228）

骨组织平衡由成骨细胞调控的骨形成和破骨细胞调控的骨吸收共同维持[1]。破骨细胞是体内唯一负责骨吸收的细胞，迁移到骨吸收的位置，黏附到钙组织上，形成褶皱区和空泡区，同时分泌质子和溶菌酶到褶皱区下方降解骨基质和胶原蛋白基质，形成骨吸收陷窝[2]。破骨细胞活性不断增强会导致骨重建失衡，进而引发多种骨疾病，例如骨质疏松症、类风湿性关节炎和畸形性骨炎[3]。抑制破骨细胞及破骨前体细胞分化是维持骨吸收和骨形成动态平衡的基本方式[4]。目前，许多双膦酸盐药物以诱导破骨细胞凋亡作为主要的抗再吸收治疗靶点。然而，它们具有一定的副作用，例如颌骨坏死和骨折风险增加[5]。因此，人们迫切希望寻找和开发治疗骨基质代谢疾病的新型天然物质。

罗非鱼是世界水产业重点养殖的淡水鱼类，其加工产品以冻罗非鱼片为主，在加工过程中产生大量鱼头、鱼皮和鱼骨等下脚料，而罗非鱼头中含有丰富的磷脂成分，可作为水产保健食品的原料进行开发利用[6]。磷脂是细胞膜的基本组成成分，具有抑制炎症、调节血脂、改善记忆、延缓衰老等多种重要生理功能，这些生理活性与其脂肪酸组成和由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）的组成密切相关[7]。与陆生生物磷脂相比，水产生物体内的磷脂富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不饱和脂肪酸，具有较高的营养价值[8]。近年研究发现磷脂具有治疗骨疾病的生物学作用：Wu Zhou等[9]在小鼠骨髓细胞培养系统中发现磷脂酰丝氨酸脂质体能够抑制破骨细胞的形成；Hartmann等[10]发现在外源性的补充卵磷脂后，大鼠对角叉菜胶性关节炎得到明显的缓解。然而，鲜见关于水产动物磷脂对破骨细胞的分化与凋亡影响的报道。因此，本实验选用罗非鱼头磷脂（tilapia head phospholipid，TH-PL），探讨其对单核巨噬细胞RAW264.7分化成破骨细胞的影响，为TH-PL作为一种治疗骨基质代谢疾病的新型功能性食品的应用提供科学依据，也为提高罗非鱼的附加值并缓解环境污染问题提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼由海南翔泰渔业股份有限公司提供；RAW264.7细胞 北京协和细胞资源中心。

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、25%胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美国Gibco公司；核因子κB受体活化因子受体的配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL） 美国Peprotech公司；DHA、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）试剂盒、罗丹明123（Rhodamine 123，Rh123） 美国Sigma公司；Muse™ Annexin V & Dead Cell试剂盒 德国Merck Millipore公司；Caspase-3抗体 美国Cell Signaling公司；GAPDH抗体 杭州贤至科技公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 德国Bruker公司；SMP7多功能酶标仪 美国Bio-Rad Laboratories公司；Z326K低温离心机 德国Hermle公司；MCO-175二氧化碳恒温培养箱 日本Sanyo公司；CKX 41SF倒置显微镜 日本Olympus公司；6890N气相色谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 TH-PL的制备

按照Chen Liping等[11]描述的方法提取罗非鱼头脂质并稍作修改。用自来水清洗罗非鱼头以去除鱼鳃等杂质，组织粉碎机粉碎，真空冷冻干燥后进行下一步实验。采用体积分数95%乙醇（料液比1∶10，m/V）在25 ℃下超声提取1.5 h，重复萃取3 次。抽滤后，将滤液真空蒸发并浓缩至浸膏状。通过氯仿-甲醇-水（8∶4∶3，V/V）溶液混悬上述脂质5 min以除去色素等杂质，然后在25 ℃、4 000 r/min离心10 min。收集氯仿层并加入0.2 倍体积的0.9 g/100 mL NaCl溶液，漩涡1 min以除去蛋白质。25 ℃、4 000 r/min离心10 min，收集下层有机相并通过旋转蒸发器浓缩，即为罗非鱼头的总脂质。将脂质溶于氯仿中，采用硅胶柱层析进行分离，用氯仿、丙酮和甲醇进行洗脱，洗脱剂与洗脱时间分别为：氯仿（0～15 min）、丙酮（15～30 min）、甲醇（30～40 min）；洗脱条件：进样量2 mL，进样质量浓度20 mg/mL，流速10 mL/min，检测波长205 nm，监测波长210 nm。最终得到组分I（fraction I，Fr I）、II（fraction II，Fr II）、III（fraction III，Fr III）。

1.3.2 薄层色谱检识

Fr III点样于被酸处理的MF-254硅胶板上（pH 5），分别以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）溶液和Dittmer-Lester试剂为展开剂和显色剂进行磷脂的薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）检识[12]。

1.3.3 FTIR分析

将TH-PL涂抹于KBr薄片上。使用红外光谱仪在4 000～500 cm-1进行光谱扫描，根据吸收峰的位置判断磷脂的特征官能团。

1.3.4 脂肪酸分析

根据Cruz-Hernandez[13]和Lei Lin[14]等的方法，进行TH-PL的脂肪酸分析。将TH-PL甲基化，用正己烷溶解于进样瓶，使用熔融CP-Sil 88石英毛细管柱（100 mh0.25 mm，0.2 μm）进行脂肪酸甲酯鉴定。氢气作为载气，流速为30 mL/min。程序性升温总共持续86 min：起始温度45 ℃，持续4 min；以13 ℃/min的速率升温至175 ℃，持续27 min；然后升至215 ℃，速率为4 ℃/min，最后在215 ℃保持35 min。对比脂肪酸甲酯标准样品色谱峰保留时间，分析TH-PL中脂肪酸的成分，并采用面积归一化法计算相对含量。

1.3.5 细胞培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养基为DMEM完全培养基（含有体积分数10% FBS、100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素），培养于T25瓶中，每天按照休积比1∶3进行传代。

1.3.6 TH-PL对RAW264.7细胞活性的影响

细胞活性采用MTT法测定。将对数生长期、密度为2h104个/mL的RAW264.7细胞接种于96 孔板，培养16 h。用含有TH-PL（0、12.5、25、50、100 μg/mL）的完全培养基继续培养2 d。随后每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）孵育4 h。小心吸去全部的液体，之后加入150 μL的DMSO室温下振荡10 min，于490 nm波长处测定吸光度。

1.3.7 TH-PL对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

RAW264.7细胞以2h104个/mL的密度接种于24 孔板，培养16 h。培养基随后分别替换为正常组培养基、破骨细胞模型组培养基（含50 ng/mL RANKL）、阳性对照组培养基（含50 ng/mL RANKL和12.5 μg/mL的DHA）和TH-PL处理组培养基（含50 ng/mL RANKL和25、50、100 μg/mL的TH-PL，分别为TH-PL低、中、高剂量组），隔天换液。培养5 d后，参照TRAP试剂盒方法进行染色。将TRAP染色阳性且细胞核数目大于3的细胞记为破骨细胞，并在100 倍倒置显微镜下计数并拍照。

1.3.8 TH-PL对破骨细胞凋亡的影响

RAW264.7细胞以2h104个/mL的密度接种于24 孔板，培养16 h后替换为破骨细胞模型组培养基，3 d后更换为阳性对照组和TH-PL处理组培养基继续培养2 d。随后用胰蛋白酶消化并收集各组细胞，PBS清洗，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，用培养基制成5h105个/mL的细胞悬液，并按照Muse™ Annexin V & Dead Cell试剂盒的方法染色。

1.3.9 TH-PL对破骨细胞线粒体膜电位的影响

收集各组细胞并向中加入1 mL荧光染料Rh123溶液（5 μg/mL），37 ℃避光孵育30 min。新鲜培养基重悬细胞后加于酶标板，用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长为490 nm，发射波长为535 nm。

1.3.10 TH-PL对破骨细胞caspase-3蛋白表达量的影响

各培养组细胞在4 ℃裂解30 min，提取细胞中的总蛋白，随后采用BCA蛋白浓度检测试剂盒统一各组的总蛋白浓度；调整后的蛋白样品加入上样缓冲液并混匀，经电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显色等步骤后，最后以GAPDH为内参计算caspase-3蛋白的表达量。

1.4 数据统计分析

数据表示为至少3 次测定的平均值±标准偏差。在SPSS 17.0软件中通过单因素方差分析不同组之间的统计学显著性。*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。使用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 TH-PL的硅胶柱层析分离和薄层色谱检识

图 1 TH-PL的硅胶柱层析图谱（a）和Fr III的薄层色谱图（b）Fig. 1 Silica gel column chromatography of TH-PL (a) and TLC of Fr III (b)

表 1 罗非鱼头总脂及分离组分的得率Table 1 Yield of total lipids and lipid components from tilapia heads

采用硅胶柱层析对罗非鱼头总脂进行分离，分别用氯仿、丙酮和甲醇洗脱，可获得Fr I、Fr III和Fr III（图1a），3 种组分得率分别为12.21%、0.75%和1.52%（表1）。Dittmer-Lester显色剂专一地对全部磷脂显色，颜色为蓝色，而对中性脂、糖脂等化合物不显色，如图1b所示，Fr III在Dittmer-Lester试剂显色下呈蓝色斑点（Rf＝0.84），而Fr I和Fr II没有呈色反应。因此，Fr III可初步鉴定为TH-PL。邹舟等[15]分析了鲢鱼头磷脂含量为0.98%，与本实验结果基本一致。综上所述，TH-PL含量相对较高，这也为进一步探讨TH-PL的生理活性提供了可靠的理论支持。

2.2 FTIR分析结果

图 2 TH-PL的傅里叶变换红外光谱图Fig. 2 FTIR spectrum of TH-PL

TH-PL的红外光谱如图2所示，波数3 424.91 cm-1的强吸收为üOH的伸缩振动；波数3 010.54 cm-1与2 853.17 cm-1的吸收峰同时出现，表明TH-PL中既含有饱和CH，又含有不饱和的CH；波数2 922.90 cm-1和1 463.73 cm-1分别为üCH2ü和üCH3的特征吸收峰；波数1 739.20 cm-1为饱和脂肪酸中C＝O的伸缩振动特征吸收峰；波数1 648 cm-1为苯环的特征吸收峰；波数1 169.04 cm-1为üC＝OüOü的特征吸收峰（sn-1）；波数1 238.85 cm-1的强吸收峰为PO2ü的伸缩振动；波数1 061.70 cm-1为CüOüPO2ü的伸缩振动；波数969.53 cm-1为CüCüN+的特征吸收峰；波数720.59 cm-1为4 个üCH2ü所组成的长链的吸收峰。本实验所得的TH-PL与文献报道的磷脂的红外光谱结果基本一致[16-17]，因此，本实验进一步定性所得样品为磷脂。

2.3 脂肪酸分析结果

表 2 TH-PL的脂肪酸组成及相对含量Table 2 Fatty acid composition and distribution of TH-PL

TH-PL的脂肪酸组成如表2所示，TH-PL中饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）约占总脂肪酸含量的34.84%，其中以C16:0（棕榈酸）为主，其次为C18:0（硬脂酸）和C14:0（豆蔻酸），与文献报道的在一些淡水鱼和海洋生物的磷脂中存在大量的棕榈酸相符[18-19]。单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）约占22.05%，其中以C18:1（油酸）为主，此外还含有一定量的C16:1（棕榈油酸）。TH-PL中多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）约占总脂肪酸的38%，其中C18:2n-6（亚油酸）含量最高，其次为C22:6n-3（DHA）和C18:3n-3（亚麻酸）等。ω-3 PUFA的含量为14.15%，其中EPA较少，而DHA含量相对较多，约占总脂肪酸的7.98%。通过上述分析得知，TH-PL中PUFA的种类丰富且含量较多，有望成为良好的功能性食品原料。

2.4 TH-PL对RAW264.7细胞活性的影响

为了检测不同质量浓度TH-PL对正常小鼠巨噬RAW264.7细胞是否具有毒性，本研究采用MTT法测定各组细胞中的活细胞数目，结果如图3所示，与空白对照组相比，TH-PL作用RAW264.7细胞2 d时，对RAW264.7细胞几乎无毒副作用，反而在高质量浓度下具有促进细胞增殖的作用。因此，可以排除TH-PL自身毒性对抑制破骨细胞活性实验所产生的假阳性作用，表明0～100 μg/mL范围内的TH-PL可用于后续的细胞实验中。

图 3 TH-PL对RAW264.7细胞活性的影响Fig. 3 Effect of TH-PL on the viability of RAW264.7 cells

2.5 TH-PL对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

采用RANKL诱导单核巨噬细胞RAW264.7分化为多核破骨细胞，结果如图4a所示，正常组RAW 264.7培养5 d后进行TRAP染色，可见大小相对均一的单核巨噬细胞，而经50 ng/mL的RANKL诱导RAW 264.7细胞5 d后可见大量TRAP阳性的多核细胞（核不少于3 个），细胞体积明显增大，表示在此条件下破骨细胞模型建立成功。图4b为TRAP阳性多核细胞的计数结果，与模型组相比，随着TH-PL质量浓度的升高，破骨细胞数量相应减少，细胞核的数量和细胞的平均直径也明显降低，呈现出一定的剂量依赖性。其中，100 μg/mL TH-PL具有显著抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化的作用，达到了与DHA阳性对照组相似的效果。Wu Zhou[9]和Ma Hongmei[20]等研究表明，在小鼠骨髓细胞培养系统中破骨前体细胞吞噬磷脂酰丝氨酸脂质体后被抑制分化为破骨细胞；Erös等[21]通过胶原诱导性关节炎小鼠模型实验发现，卵磷脂对慢性关节炎的形态功能和微循环特征产生积极作用。上述研究表明了，磷脂类物质具有抑制骨质疏松的效果，与本实验结果相符。但TH-PL的组成较为复杂，有待于进一步对其骨质疏松构效关系进行研究。

图 4 TH-PL对RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的影响Fig. 4 Effect of TH-PL on RANKL-induced differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts

2.6 TH-PL对破骨细胞凋亡的影响

细胞凋亡是一种程序性死亡，由细胞主动有序高度调控，是生物体内衰老细胞和损伤细胞死亡的重要方式[22]。经研究表明，破骨细胞凋亡是调节成骨细胞和破骨细胞之间动态平衡的关键性因素[23-24]。为了明确TH-PL对破骨细胞凋亡的作用效果，本研究以DHA为阳性对照，采用不同质量浓度的TH-PL诱导破骨细胞2 d，然后利用流式细胞仪检测破骨细胞凋亡率，结果如图5所示，质量浓度为50、100 μg/mL的TH-PL和DHA均可显著促进破骨细胞的凋亡，总凋亡率分别为12.07%、24.17%、22.07%，且主要为早期凋亡（Q1）。Sakakima等[25]研究发现，磷脂酰胆碱通过诱导肝癌细胞Hep-G2的凋亡（凋亡率为3.11%），进而抑制癌细胞的生长。王亮等[26]也报道了肝源性磷脂酰乙醇胺能够激活SMMC-7721细胞凋亡过程中关键性调节基因bcl-2和caspase-3的表达，从而诱发癌细胞凋亡。上述研究表明，磷脂类物质具有诱导细胞发生凋亡的效果，本研究发现TH-PL能有效促进破骨细胞的凋亡，进一步揭示了脂类物质抗骨质疏松作用的分子机理，为磷脂类物质抗骨质疏松作用的深入研究提供了参考。

图 5 TH-PL对破骨细胞凋亡的影响Fig. 5 Effect of TH-PL on osteoclast apoptosis

2.7 TH-PL对破骨细胞线粒体膜电位及caspase-3蛋白表达量的影响

图 6 TH-PL对线粒体膜电位（a）及细胞内caspase-3蛋白表达量（b）的影响Fig. 6 Effect of TH-PL on mitochondrial membrane potential (a) and expression of caspase-3 in osteoclasts (b)

当细胞受到各种凋亡信号的刺激后，会导致线粒体膜电位降低，呼吸链断裂，进而诱导细胞凋亡[27]。研究证明，线粒体膜电位与破骨细胞凋亡密切相关[28-29]。为了明确TH-PL对破骨细胞线粒体膜电位的作用效果，本研究通过对细胞进行Rh123染色，检测其荧光强度，以反映细胞线粒体膜电位高低。结果如图6a所示，不同质量浓度（25、50、100 μg/mL）TH-PL干预破骨细胞后，细胞荧光强度逐渐下降，且呈剂量依赖性。当TH-PL的质量浓度为100 μg/mL时细胞线粒体膜电位下降到76.10%（与模型组相比）。为进一步探讨TH-PL对破骨细胞线粒体凋亡传导通路的影响，实验采用Western blotting方法检测TH-PL处理后破骨细胞中caspase-3表达量的变化情况。结果如图6b显示，与模型组相比，用50、100 μg/mL TH-PL干预细胞后，显著地提高了caspase-3的表达量。Kim等[30]研究表明DHA可通过增加Bcl-2家族蛋白Bim的表达来促进成熟破骨细胞凋亡。在外界刺激作用下，Bim表达增高或活性增强后激活Bak/Bax，活化的Bak/Bax形成六聚体聚集在线粒体外膜形成孔道，导致线粒体功能紊乱，释放细胞色素c，与凋亡酶激活因子Apaf-1、ATP结合形成的多聚体募集并活化胱天蛋白酶caspase-9，最终激活下游执行者caspase-3、caspase-7，导致细胞凋亡[31-32]。在本研究中观察到TH-PL诱导破骨细胞凋亡，并且通过线粒体膜电位的降低，caspase-3的激活来介导该作用，因此推测，TH-PL可能是通过线粒体通路诱导破骨细胞发生凋亡，进而影响破骨细胞的活性。

3 结 论

本研究采用溶剂法提取罗非鱼头总脂，通过硅胶柱层析分离得到磷脂组分TH-PL，其占罗非鱼头干质量的1.52%；通过TLC和FTIR法鉴定确认，其具有磷脂的基本性质与结构；气相色谱分析结果显示，TH-PL含有丰富的PUFA，约占总脂肪酸含量的38%。采用RAW264.7细胞在体外成功建立破骨细胞模型，并利用上述模型确认TH-PL具有显著抑制RAW264.7分化为破骨细胞的作用。进一步研究表明，TH-PL可破坏破骨细胞线粒体膜完整性，降低线粒体跨膜电位，并提高细胞内促凋亡蛋白caspase-3的表达量，从而诱导破骨细胞凋亡，当TH-PL质量浓度为100 μg/mL时，破骨细胞总凋亡率达到24.17%。

综上所述，本研究制备的TH-PL在一定质量浓度下具有显著抑制破骨前体细胞分化和促进破骨细胞凋亡的作用，有望成为抑制骨质疏松作用的功能性食品原料。