不同辐射剂量紫外线诱导金黄色葡萄球菌L型变异的探究活动

林洁丹

（汕头市卫生学校，广东 汕头 515000）

在病原生物学课上，“L型细菌”是个重要的概念。L型细菌是正常细菌发生形状结构的变异，其最主要的特征是细胞壁缺陷，表现出形态的高度多形性。临床实践发现多种细菌可发生L型变异，且变异后的L型细菌具有一定的致病力和耐药性，但常容易误诊或漏检，成为医院内感染的重要致病菌之一。目前，L型细菌的检出是医学检验专业必学必会的内容。紫外线是常用的一种消毒方法，其杀菌原理主要是引起细胞内DNA分子发生多种形式的结构改变，如DNA链的断裂、DNA和蛋白质交联、形成嘧啶二聚体等[1]。紫外线在一定条件下也能诱导细菌形成L型变异[2]。本实验是通过金黄色葡萄球菌对紫外线的不同辐射敏感性，为病原生物学教学提供一种探究细菌变异获得L型细菌的实验方法。

1 实验材料

金黄色葡萄球菌、牛肉浸液、蛋白胨、氯化钠、琼脂、人血浆、蒸馏水、95%的酒精、L型玻璃涂布棒、培养皿、酒精灯、无菌三角烧瓶、高压灭菌锅、紫外线灭菌灯、紫外线强度指示卡、细菌培养箱。

2 培养基制备

2.1 L型琼脂培养基

1000mL新鲜牛肉浸液，加入蛋白胨20 g、氯化钠45 g、琼脂8 g，加热溶解，调pH值至7.4～7.6，分装于三角烧瓶内，121℃压力蒸气灭菌15 min，待冷至50℃左右，加入20%灭活人血浆，混匀，倾注平板。

2.2 普通营养琼脂培养基

1000mL新鲜牛肉浸液，加入蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g，调pH值至7.4～7.6，高压蒸气灭菌5 min，倾注平板。

3 实验步骤

3.1 制备菌悬液并涂布

取金黄色葡萄球菌16～18 h培养液5 mL，按1∶4加入无菌蒸馏水稀释后制成菌悬液。取菌液100 μL用L型玻璃涂布棒均匀涂布于已倾注琼脂的普通培养基和L型培养基（每一照射剂量各涂布5个），取相同菌液同样操作于未倾注琼脂的平板（干燥玻璃平板，待紫外线照射后才倾注普通培养基和L型培养基），同时做阳性对照。L型玻璃涂布棒预先浸入95%的酒精消毒，使用前经酒精灯火焰上过一下。

3.2 紫外线照射

待干燥玻璃平板干后，除对照组外，所有待检平板置于超净工作台的紫外线灯管下，距离100 cm，强度 90 μW/cm2，分别照射 20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，在干燥玻璃平板上倾注普通培养基和L型培养基，然后把所有待检培养皿放入37℃温箱中培养48～72 h，观察菌落情况，取可疑菌落进行革兰染色和细胞壁染色确认。

4 实验结果

4.1 细菌L型的形成

在不同辐射剂量紫外线照射后，绝大部分金黄色葡萄球菌被杀死，尤其是照射后倾注琼脂的平板未见细菌生长（包括普通培养基和L型培养基）。只有极少数细菌能在倾注琼脂后照射的平板存活。其中，L型培养基上除个别仍保持原态外，基本都被诱导成L型细菌，照射30 min形成L型菌落最多，而普通培养基原型菌较多。结果见表。

紫外线照射诱导细菌L型的形成表

4.2 细菌L型的鉴定

未经紫外线照射的对照组，无论是在普通培养基还是在L型培养基，细菌均能正常生长。只是在L型培养基的菌落较小，但菌落色素、形态与普通培养基一样，经革兰染色和细胞壁染色确认是原型菌。经紫外线照射诱导的L型菌落呈针尖大小，低倍镜下多数为颗粒型菌落，少数为“油煎蛋”样菌落。L型菌经革兰染色后油镜观察，发现菌体呈多形性，可见染色不均匀的圆球体、长丝体。细胞壁染色菌体呈深紫色，表明细胞壁缺陷，染液渗入菌体内。对照菌（无细胞壁缺陷）仅菌体周边染上紫色，内部无色。

5 讨论

L型细菌是一种细菌细胞壁形成受到抑制的特殊的生长方式，可自发形成或经人工诱导形成[2]。本实验结果表明：紫外线能诱导金黄色葡萄球菌形成L型菌，L型培养基更适宜L型细菌的生长。推测L型培养基特殊的高渗环境可以稳住诱导形成的L型细菌的菌形不变，提高培养阳性率。L型培养基的高营养也可能是诱导成功的一个重要因素。因为高质的营养可获得足够数量的处于对数生长期的菌株，该期细菌的细胞壁合成旺盛，紫外线在此阶段对其细胞壁作用明显。研究还发现，在162 000 μW ·s/cm2辐射剂量下，L型培养基诱导形成L型菌的几率较高。随着紫外线辐射剂量的增多，杀菌率逐渐增多，L型菌的形成率下降。推测细菌在恶劣环境下形成L型菌是一种生存策略，L型细菌对紫外线具有一定的抵抗力[3]。本实验中，干燥玻璃平板直接涂布细菌“待干”后，经紫外线照射均未见有L型细菌和原型细菌的生长。提示：紫外线穿透力弱，湿度会影响辐射效果。临床运用时要避免空气及物体表面湿度对消毒效果的影响。运用紫外线诱导细菌变异获得L型细菌，教学仪器设备、耗材均较低，方法简便，阳性检出率较高，便于学生掌握L型细菌的形态特点，避免今后实习和工作中出现漏检，提高实验教学效果。