正交试验优化鲬鱼微冻复合保鲜剂配方研究

徐倩，刘晓攀，赵永慧，胡馨月，刘冰，赵行，王祥鹏，盘赛昆，3，4，*

（1.淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港222005；2.江苏天边渔村食品有限公司，江苏连云港222100；3.江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港222005；4.淮海工学院江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港222005）

鲬鱼（Platycephalus indicus）又名印度鲬、牛尾鱼，广泛分布于中国沿海各水域以及日本南部海域，为我国近海常见经济鱼类之一，也是我国重要的出口鱼类[1]。因其味道鲜美，富含高蛋白、多种维生素和矿物质等，具有较高的营养价值和保健价值深受消费者欢迎。但是，由于鲬鱼水分含量高，蛋白含量丰富，在储运、加工及销售过程中极易腐败变质，从而导致资源浪费和经济损失。因此，寻找一种适宜的保鲜技术来延长鲬鱼的货架期具有重要的现实意义和应用价值。国内外对水产品保鲜的研究更趋向于保鲜剂结合其他处理方式，以发挥其协同效应，达到抑菌保鲜的效果[2]。现有的保鲜方式主要有低温保鲜、保鲜剂保鲜、气调保鲜与辐照保鲜，其中保鲜剂结合低温保鲜是水产品常用保鲜技术[3]。现有研究表明，复合保鲜剂的综合保鲜效果优于单一保鲜剂。如张璟晶等[4]将0.4 g/L溶菌酶、0.4 g/L Nisin 与5 g/L 壳聚糖复配使用，在冷藏条件下可将银鲳的一级鲜度延长2 d～3 d，二级鲜度延长6 d～7 d。国外研究者发现Nisin、茶多酚与壳聚糖复配协同效果良好，能明显抑制微生物的生长[5]。

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶叶中多羟基酚类化合物的混合物。其易溶于水和有机溶剂，具有抗氧化和清除自由基、抑制微生物生长、抑制肿瘤细胞生长等多种生物活性，应用于食品贮藏与医疗卫生等领域，尤其在水产品保藏中得到较好应用[6]。壳聚糖（chitosan，CH）是甲壳素经化学处理脱乙酰基后的产物。壳聚糖含有游离氨基，能溶于低酸度水溶液中，是一种碱性多糖，其抑菌范围广、抗菌活性强、安全无毒，作为一种新型的动物源保鲜剂，在果蔬与水产品保鲜中得到普遍应用[7]。普鲁兰多糖（pullulan polysaccha ride，PP）是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性黏质多糖，其分子量在20 kDa～2 000 kDa，易溶于水，无毒无害，成膜性、阻气性、可塑性和黏性均较强，己广泛应用于果蔬、肉类等保鲜[8]。且GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[9]规定，以上3 种添加剂均允许在水产品及其制品中使用。成媛媛等[10]将0.5%普鲁兰多糖液用于草鱼鱼肉，在25 ℃条件下储藏12 h 后其菌落总数和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值均显著低于空白对照组，保鲜效果最好。目前，国内外学者对鲬鱼的研究甚少，主要集中在生物学方面，对研究鲬鱼的贮藏保鲜缺乏相关报道。另外，水产领域常用的低温保鲜技术有冷藏保鲜、冰温保鲜、微冻保鲜以及冻结等保鲜技术[11]。其中，微冻保鲜技术是公认的低温条件下可较好维持食物品质的方法[12]。微冻保鲜所需温度区域介于冷藏和冻结之间。在这一温度区域内微生物活性受到抑制，大多数细菌无法正常生长，同时内源酶的活力也受到抑制。鉴于此，本文选用微冻保藏观察鲬鱼贮运期间的品质变化，并配以茶多酚、壳聚糖和普鲁兰多糖这3 种天然食品保鲜剂来进行品质调控，旨在为鲬鱼贮藏保鲜及延长货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲬鱼[体长约（380±10）mm，平均体重（100±10）g]：市购；茶多酚（多酚含量≥98%）、壳聚糖（脱乙酰度≥90%）、普鲁兰多糖（纯度≥98%）（食品级）：河南巧手食品添加剂有限公司；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid value，TBA）（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸、丙二醛（分析纯）：南京化学试剂有限公司；甘油、硼酸、盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722s 型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；WSC-S 型测色色差计：上海仪电物理光学仪器有限公司；S20 型pH 计：梅特勒·托利多集团；BD-102型卧式冷冻柜：青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理流程

将新鲜鲬鱼经过去头、去尾、去内脏的“三去”处理后，用流水洗净后晾干，浸渍于不同配比的保鲜液中，鲬鱼与保鲜液的质量体积比为2 ∶1，5 min 后捞出沥干，用无菌保鲜袋分装，放入冰箱于（-5±1）℃微冻，每隔 5 d 取样测定 TVB-N 值、TBA 值、pH 值和色差值。未浸保鲜液的样品设为空白对照。

用无菌蒸馏水分别将茶多酚、普鲁兰多糖和壳聚糖（壳聚糖配制时需另加1%的冰醋酸）配制成不同浓度的溶液备用。

1.3.3 单因素试验设计

采用单因素试验，考察茶多酚、壳聚糖和普鲁兰多糖对鲬鱼微冻贮藏条件下的品质影响。茶多酚溶液质量分数设定为0.2%、0.4%、0.6%、壳聚糖溶液质量分数设定为1.0%、1.5%、2.0%、普鲁兰多糖溶液质量分数设定为0.25 %、0.5 %、0.75 %，每个水平设3 个重复。

1.3.4 复合保鲜剂配比优选

根据单因素试验结果，以茶多酚、壳聚糖和普鲁兰多糖溶液质量分数为因素，每个因素设3 个水平，以储存16 d 后鲬鱼的TVB-N 值为参考指标，采用L9（34）正交试验优选复合保鲜剂配比。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 TVB-N 值

随着供暖季临近，中国石化天然气保供工作全面提速。据统计，1至9月，中国石化累计供应天然气290.1亿立方米，同比增长18.1%。其中，LNG累计进口88.6亿立方米，同比增加59.7%。中国石化正在加快鄂尔多斯-安平-沧州管道一期工程建设，预计11月中旬投产并实现向河北供气。

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[13]，采用第二法进行测定，平行测定3 次。

1.3.6 TBA 值

参考Sui 等[14]并做修改，称取5 g 搅碎鱼肉于锥形瓶内，加入25 mL7.5%的三氯乙酸混合液，振摇30 min，过滤2 次，取5 mL 滤液至25 mL 比色管中，再加入5 mL TBA 水溶液（0.02 mol/L），混匀后加塞，在（90±1）℃水浴 40 min，取出，冷却至 25℃，1 600 r/min 离心 5 min，取上清液加5 mL 氯仿，摇匀并静置，吸取上清液在532 nm 波长下测定吸光度。TBA 值用丙二醛的质量分数表示。

式中：C 为从标准曲线查得丙二醛的微克数，μg；m 为样品质量，g。

1.3.7 pH 值

参照谢晶等[15]建立的方法进行pH 值测定，称取10.0 g 鱼肉，绞碎后加90 mL 煮沸冷却过的蒸馏水，振荡30 min 后过滤，用精密pH 计来测定其pH 值。

1.3.8 色差值

采用WSC-S 色差分析仪来测定鱼肉的颜色变化。L*（lightness）为明度指数、a*（redness/greenness）表示红绿偏差、b*（yellowness/blueness）表示黄蓝偏差值，3 个指标值先用白板校准。L*=0 表示黑色，L*=100 表示白色；a*和b*为彩度指数，+a*表示红色，-a*表示绿色，+b*表示黄色，-b*表示蓝色。总颜色差异E*，用[（L*）2+（a*）2+（b*）2]1/2表示，E*越大，说明色差越大。

1.4 数据处理

试验数据均为3 次以上重复试验，用正交设计助手Ⅱ和Excel 软件进行数据分析，并以±SD 表示。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对鲬鱼冷冻保藏效果的影响

茶多酚对鲬鱼冷冻保藏效果的影响见图1。图1（a）表示不同浓度的TP 对鲬鱼贮藏过程中TVB-N 值的影响。TVB-N 值是水产品在细菌和酶的作用下分解产生氨及低级胺类化合物，常测其总氮量作为鱼类的鲜度指标。GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》[16]规定海水鱼 TVB-N 值（mg/100 g）≤30在可接受范围内。图1（b）表示不同浓度的TP 对鲬鱼贮藏过程中TBA 值的影响。TBA 值是指肉类、鱼类等动物性油脂中不饱和脂肪酸氧化分解后所产生的衍生物如丙二醛（malondialdehyde，MDA）等与 TBA 试剂反应的结果[17]。TBA 值越大，脂肪的氧化程度越高，因此TBA 值是测定水产品脂肪氧化酸败程度的良好判断指标。图1（c）表示不同浓度的TP 对鲬鱼贮藏过程中pH 值的影响。图1（d）表示不同浓度的TP 对鲬鱼贮藏过程中色差的影响。颜色的变化主要源于鱼肉蛋白质氧化后血红蛋白的减少导致的整体色差的下降。

图1 不同浓度的茶多酚对鲬鱼冷藏效果的影响Fig.1 Effect of different concentrations of tea polyphenols on the effect of Platycephalus induicus

如图1（a）所示，随着贮藏时间的延长，TVB-N 值不断上升。其中，采用0.2%的TP 处理的鲬鱼TVB-N值最低，第 16 天时其 TVB-N 值为（21.55±0.27）mg/100 g，而空白对照组的 TVB-N 值为（30.98±0.82）mg/100 g，与空白对照组相比具有显著性差异（P<0.05）。如图1（b）所示，鲬鱼在整个冷藏过程中的TBA 值呈不断上升趋势，这表明鱼肉氧化酸败程度越来越严重。添加TP 的试验组均能延缓鲬鱼的TBA 值，说明TP 能有效抑制鲬鱼脂肪氧化酸败。其中，0.2%的TP 处理的鲬鱼TVB 值最低，第 16 天时其 TBA 值为 0.275 mg/kg 显著低于空白对照组的TBA 值为0.434 mg/kg（P<0.05）。如图1（c）所示，鲬鱼在整个贮藏过程中呈现先降低后升高的V 型趋势，这与苏辉等[18]的研究结果类似。鲬鱼样品的pH 值在最初6 d 内呈现出下降趋势，第6 天时，空白对照组pH 值明显增加。随着鲬鱼贮藏时间的延长，蛋白质被分解成碱性的胺及氨类物质，pH 值逐渐升高。pH 值越大，表明样品的腐败程度越高。采用TP 处理后的样品，其pH 值均较空白对照组低，其中0.2%处理的pH 值最低。如图1（d）所示，空白对照组的色差在小范围内呈现下降趋势，0.2%的TP 对于降低色差变化的效果最佳。

2.2 壳聚糖对鲬鱼冷冻保藏效果的影响

壳聚糖对鲬鱼冷冻保藏效果的影响见图2。

图2 不同浓度的CH 对鲬鱼冷藏效果的影响Fig.2 Effects of different concentrations of chitosan on the effect of Platycephalus induicus

图2（a）表示不同浓度的CH 对鲬鱼贮藏过程中TVB-N 值的影响。随着贮藏时间的延长，用CH 处理鲬鱼的TVB-N 值低于对照组。其中采用1.0%的CH处理鲬鱼的TVB-N 值最低，到贮藏末期（16 d）其TVB-N 值为（18.80±1.14）mg/100 g 显著低于对照组的TVB-N 值（30.25±0.82）mg/100 g（P<0.05）。李婷婷等[19]的研究表明，壳聚糖用于处理大黄鱼能够明显降低TVB-N 值，从而降低腐败的速率，CH 处理鲬鱼具有相似的现象。图2（b）表示不同浓度的CH 对鲬鱼贮藏过程中TBA 值的影响。随着时间的延长，所有组的TBA值总体呈上升趋势，其中，1.0%CH 试验组的TBA 值均低于其它3 组。在第16 天时，1.0%CH 试验组TBA值为0.24 mg/kg 显著低于空白对照组的0.434 mg/kg。因为壳聚糖具有良好的成膜性，能够有效阻隔氧气，从而抑制脂质氧化。图2（c）表示不同浓度的CH 对鲬鱼贮藏过程中pH 值的影响。如图2（c）所示，随着时间的延长，pH 值呈先下降后上升的趋势。其中，1.0%的试验组和空白对照组相比具有显著性差异。这说明一定浓度的CH 能够有效抑制鱼体腐败微生物的繁殖，保持鱼肉品质。图2（d）表示，不同浓度的CH 对鲬鱼贮藏过程中色差的影响。如图（d）所示，随着时间的延长，各试验组的色差值总体呈下降趋势。其中，1.0%CH 对鲬鱼贮藏过程中影响效果最好，且与空白对照组有显著差异。

2.3 普鲁兰多糖对鲬鱼冷冻保藏效果的影响

普鲁兰多糖对鲬鱼冷冻保藏效果的影响见图3。

图3 不同浓度的普鲁兰多糖对鲬鱼冷藏效果的影响Fig.3 Effects of different concentrations of pullulan polysaccharides on the effect of Platycephalus induicus

图3（a）表示不同浓度的PP 对鲬鱼贮藏过程中T VB-N 值的影响。如图（a）所示，空白试验组的TVB-N值增加非常迅速，在第16 天时其TVB-N 值达（31.79±0.82）mg/100 g；而经 PP 处理的鲬鱼其 TVB-N 值增加较缓，尤其是经0.25%PP 处理的鲬鱼在贮藏16 d 后其 TVB-N 值仅为（20.19±1.91）mg/100 g，由此可见 PP能有效抑制鲬鱼体内TVB-N 的产生，其主要缘于PP良好的阻氧性抑制了鲬鱼体内酶和细菌的生物活性[20]。图3（b）表示不同浓度的PP 对鲬鱼贮藏过程中TBA值的影响。如图3（b）所示，经过PP 处理后的鲬鱼TBA值高于空白对照组，但在试验第16 天时，PP 处理过的样品则表现出TBA 值明显低于空白对照组的TBA值，说明达到PP 对于水产品的贮藏效果需要一定时间。其中，0.25%PP 处理的效果最佳，说明浓度过高的PP 形成的膜可能对于O2的选择通过性不如低浓度的PP 效果好。图3（c）表示不同浓度的PP 对鲬鱼贮藏过程中pH 值的影响。如图3（c）所示，鲬鱼的pH 值随着贮藏时间的延长呈先下降后上升趋势，经PP 处理后，鲬鱼的pH 值变化较缓慢，其中0.25%PP 试验组较明显。图3（d）表示不同浓度的PP 对鲬鱼贮藏过程中色差值的影响。如图3（d）所示，随着贮藏时间的延长，鲬鱼的色差值呈缓慢下降趋势。其中，0.25%和0.75%的PP 处理过的鲬鱼色差值变化范围较小，综合以上3 个测定指标选择0.25%PP 试验组为最佳。

2.4 复配结果

根据单因素试验结果，以鲬鱼储藏16 d 后的TVB-N 值为指标进行复合保鲜剂最佳配比优化。试验方案设计与结果见表2。

表2 鲬鱼复合保鲜剂最佳比例正交试验结果Table 2 Results of Platycephalus indicus fresh-keeping orthogonal experiment

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the analysis orthogonal array design

由表2、表3 分析可知，壳聚糖和茶多酚对微冻鲬鱼TVB-N 值的影响效果显著，普鲁兰多糖的影响不显著。各因素对微冻鲬鱼TVB-N 值的影响主次顺序为A＞B＞C，即壳聚糖用量＞茶多酚用量＞普鲁兰多糖用量。复配组合A1B2C1为减缓TVB-N 值增加的最优配比。即复合保鲜剂的最佳配比为0.8%CH、0.2%TP 和0.15%PP。

2.5 验证试验

采用正交后的最佳复配进行验证试验，即采用0.8%CH、0.2%TP 和 0.15%PP 进行复配在第 16 天测定 TVB-N 值、TBA 值、pH 值和总色差，其结果分别为10.526 mg/100 g、0.162 mg/kg、7.01、40.25，符合国家标准GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》的卫生指标。

3 结论

采用正交试验组合复配3 种保鲜剂，对3 种保鲜剂复合使用的浓度进行了优化，最终确定了鲬鱼贮藏保鲜剂的工艺参数为CH 添加量为0.8%、TP 添加量为0.2%、PP 添加量为0.15%，在此配方条件下对鲬鱼微冻保藏16 d，产品各项指标均明显优于空白对照组，说明这3 种保鲜剂处理鲬鱼后再进行微冻保鲜能抑制细菌繁殖，延缓腐败变质，改善鲬鱼保藏品质。