HPLC法测定不同产地、生长年限、采收期的京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量

冯雪梅，毕楚遥，许冰，孟勤

（1.吉林大学药学院天然药化教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学，吉大一院放射科，吉林 长春 130021；3.吉林大学药学院药学实验中心，吉林 长春 130021）

京大戟为大戟科植物大戟（Euphorbia pekinensis Rupr.）的干燥根，主要分布在我国江苏、四川、江西、广西等省区，秋末或春初采挖。已报道的京大戟中含有大戟苷、大戟酸、三萜醇、有机酸、鞣质、树脂胶、糖等[1]。其中，大戟二烯醇首次写入2015 版《中国药典》[2]，作为京大戟质量评价的有效成分。近年来，由于京大戟具有毒性，导致国内外主要针对于京大戟的药理毒理进行研究，较少涉及对不同产地不同采收期大戟二烯醇含量变化的研究，质量分析评价不是很完整。甘遂为大戟科植物甘遂（Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang）的干燥块根，主要分布于甘肃、山西、陕西、宁夏、河南等省区，春季开花前或秋季枯苗后采挖。京大戟和甘遂均具泻水逐饮，消肿散结之功效，且均以大戟二烯醇作为药材质量标准中含量检测的成分。药典规定京大戟中大戟二烯醇含量不少于0.60%；甘遂中大戟二烯醇含量不少于0.12%。为了控制质量，确保疗效，采用高效液相色谱(HPLC)法对大戟二烯醇进行含量测定[3-9]。为此，本试验采集了不同产地的18 批次京大戟和甘遂药材，江苏省基地不同生长年限、不同采收期的京大戟和山西省基地不同生长年限、不同采收期的甘遂药材进行大戟二烯醇的含量测定分析，为确定京大戟和甘遂最佳的产地、最佳生长年限和采收期提供数据支持，为进一步扩大开发和利用京大戟和甘遂资源提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Series Ⅲ 双泵高效液相色谱仪（美国SSI公司）；KQ-250DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BT125D电子天平（0.01 mg，德国赛得利斯公司）。

1.2 试剂

大戟二烯醇对照品系吉林大学药学院天然药化教研室自制（归一化法测定其质量分数为99.00%）；甲醇、乙醇皆为分析纯（北京化工厂）；乙腈为色谱纯（上海星可高纯溶剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水。

1.3 试材

京大戟药材，购自安徽亳州药材市场，经孟勤教授鉴定为京大戟（E.pekinensis Rupr.）的干燥根；甘遂药材，购自安徽亳州药材市场，经孟勤教授鉴定为甘遂（E.kansui T.N.Liou ex T.P.Wang）的干燥块根。2 种药材均粉碎过60 目筛，混合均匀，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil XBP C18 柱（4.6 mm 250 mm，5m）；流动相系统：乙腈-水（92∶8）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：210 nm。在此色谱条件下，大戟二烯醇对照品溶液及供试品溶液在210 nm 处色谱图见图1。

图1 大戟二烯醇对照品（a）和京大戟（b）的HPLC 图谱Fig.1 HPLC chromatograms of euphol reference(a)and Euphorbia pekinensis(b)

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取大戟二烯醇对照品2.10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成大戟二烯醇对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取药材粉末2 g，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，精密称重。超声提取30 min，冷却至室温，精密称重，用乙酸乙酯补足减失的重量，摇匀后过滤，弃去初滤液，取续滤液，过0.45m微孔滤膜，即得供试品溶液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线和线性范围 分别精密吸取大戟二烯醇对照品溶液 2、6、10、15、20、25L，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件测定，以大戟二烯醇进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算得出线性回归方程为Y=456628X 302740（r=0.9991），表明大戟二烯醇对照品进样量在0.42～5.25g与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，连续进样6 次，测定峰面积，计算得大戟二烯醇含量的RSD为0.97%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取6 份药材粉末各2.0 g，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算得大戟二烯醇的平均含量为0.683%，RSD值为1.40%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下的色谱条件进行分析，测定峰面积，计算RSD 值为0.44%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取同一已知含量的6份京大戟药材粉末各0.25 g，分别加入大戟二烯醇对照品1.525 mg，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取供试液10L，在“2.1”项下的色谱条件下进样测定，计算得大戟二烯醇的平均回收率为99.97%，RSD为1.06%（表1），表明该测定方法加样回收率良好。

表1 加样回收率试验结果Table 1 Results of recovery test

2.4 不同产地京大戟和甘遂中大戟二烯的含量测定

取6个不同产地共计18批次供试样品，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算大戟二烯醇含量。从表2 可以看出，不同产地的药材中大戟二烯醇含量存在较大差异。以江苏产的京大戟中大戟二烯醇含量最高，广西产的大戟二烯醇含量最低且未达到药典标准；以山西产的甘遂中大戟二烯醇含量最高，以陕西产的大戟二烯醇含量最低。

表2 不同产地样品中大戟二烯醇含量Table 2 Euphordienol content in samples from different origins

2.5 不同生长年限京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比较

取不同生长年限的京大戟和甘遂供试样品，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算大戟二烯醇含量。从表3 可以看出，不同生长年限的药材中大戟二烯醇含量存在差异。比较2、3、4年生的药材中大戟二烯醇含量发现，3年生京大戟中大戟二烯醇含量最高，4年生京大戟中大戟二烯醇含量最低；2年生甘遂中大戟二烯醇含量最高，4年生甘遂中大戟二烯醇含量最低。

表3 不同生长年限春季采收期京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比较Table 3 Comparison of euphol from E .pekinensis and E kansuiin spring harvesting periods with different growing years

2.6 不同采收期京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比较

取不同采收期的京大戟和甘遂供试样品，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算大戟二烯醇含量。从表4 可以看出，京大戟在秋季采收时的大戟二烯醇含量比春季采收时高，甘遂在春季采收时的大戟二烯醇含量比秋季采收时高。

表4 不同采收期京大戟和甘遂中大戟二烯醇含量比较Table 4 Comparison of euphol from E .pekinensis and E kansuiin different harvest periods

3 讨论与结论

3.1 提取溶剂选择

2015年版《中国药典》中，甘遂药材含量测定的供试品处理方法中的提取溶剂为乙酸乙酯，京大戟药材含量测定的供试品处理方法中的提取溶剂为甲醇。试验中2 种药材分别用2 种溶剂提取后比较发现，乙酸乙酯对2 种药材中大戟二烯醇有更高的提取效率，故选定乙酸乙酯作为提取溶剂。

3.2 不同产地药材质量存在一定差异

不同产地的药材中大戟二烯醇含量存在较大差异。以江苏产的京大戟中大戟二烯醇含量最高，广西产的大戟二烯醇含量最低且未达到药典标准；以山西产的甘遂中大戟二烯醇含量最高，以陕西产的大戟二烯醇含量最低。

在药材市场搜集京大戟药材过程中，发现多数商家以红大戟代替京大戟出售，或者将红大戟和京大戟统称为大戟出售。分析原因可能京大戟多为野生、产量少，红大戟多为种植、产量大，并且二者均有泄水逐饮之功效。大戟二烯醇是京大戟和甘遂的有效成分之一，保证大戟二烯醇的含量才能基本保证药效。然而参阅文献，并无红大戟中发现有大戟二烯醇成分的报道，所以以红大戟替代京大戟用药是极不合理的。购买时需加以区分，谨慎购买[10]。

3.3 最佳采收时间

不同生长年限的药材中大戟二烯醇含量存在差异。比较2、3、4年生的药材中大戟二烯醇含量发现，3年生京大戟中大戟二烯醇含量最高，4年生京大戟中大戟二烯醇含量最低；2年生甘遂中大戟二烯醇含量最高，4年生甘遂中大戟二烯醇含量最低。京大戟在秋季采收时的大戟二烯醇含量比春季采收时高，甘遂在春季采收时的大戟二烯醇含量比秋季采收时高。该研究结果可为药农确定京大戟和甘遂最佳生长年限及采收期提供科学依据，为进一步扩大开发和利用京大戟和甘遂资源提供科学依据。