人工RNA结合骨架的可溶性表达及其与寡核苷酸链的相互作用分析

徐如飞，徐奕倩，陈倩倩，蒋培蓉，陈美雯，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

PUF结合因子（Pumilio/fem-3 binding factor）是一种存在于真核细胞、结合单链RNA分子的RNA结合蛋白，具有转录后调控蛋白质表达的重要功能。PUF由RNA结合骨架（RNA-binding scaffold，RBS）和辅助结构域构成，其RNA结合骨架大部分含有由α-螺旋构成的8个RNA结合域（RNA binding domain，RBD），天然PUF碱基特异性的解析为人工设计特异性结合任意8个核苷酸RNA分子的RBS（engineered RBS，ERBS）奠定了基础[5]。

PUF蛋白家族是RBP中的一个大家族，存在于所有真核生物中，其基因的拷贝数在不同物种中差异很大。PUF蛋白主要通过特异性结合目标mRNA的顺式作用因子，影响mRNA的稳定性、定位和翻译过程，参与胚胎形成、细胞发育和分化等过程，实现基因的转录后调控[6-8]。

据报道，在原核细胞中，PUF蛋白结合于靶基因的RBS和起始密码子之间，调控翻译；在真核细胞中，PUF蛋白结合于靶mRNA的5′非翻译区，显著抑制了靶基因的表达[9]。调控机制可能是由于PUF蛋白结合RNA之后，与其他的蛋白相互作用，进而抑制翻译或引起mRNA降解[10]。

利用Escherichia coli等原核表达体系表达重组蛋白，由于表达水平高及二硫键发生错配，导致80%会以不溶性的包涵体形式存在[11-12]，在分离纯化蛋白之前，需要经过变性和复性，变性的蛋白质因为构象被破坏，不具备生物学活性。因此，需要通过复性使蛋白质恢复其天然构象状态，具有正确的生物学功能。变性和复性的过程比较复杂，而且难度大，因此，可溶性表达重组蛋白具有很重要的生物学意义[13-14]。

据报道，提高重组蛋白的可溶性表达可以采用以下几种方式：第一，选择合适的宿主，BL21（DE3）是通常选择的宿主细胞[15]；第二，构建蛋白，比如将目的蛋白与一些可溶性蛋白表达，可以提高目的蛋白的溶解性，但是分离纯化之后需要切除辅助蛋白[16-19]；第三，降低培养温度，大肠杆菌的最适生长温度为37℃左右，因此，37℃诱导蛋白很容易导致不溶性的包涵体形成，研究显示，低温诱导更有利于正确蛋白的折叠，导致其可溶性增加[20-24]；第四，改善诱导条件，在菌体生长的对数生长期诱导，更有利于可溶性蛋白的形成，降低诱导剂的使用量有利于蛋白的缓慢表达，从而更有利于可溶性蛋白的形成[25]。

本研究利用ERBS蛋白可以结合单链RNA的特点，设计5'-FAM标记寡核苷酸，通过检测5′-FAM标记寡核苷酸荧光强度的变化来分析ERBS蛋白与寡核苷酸的相互作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Escherichia coliDH5α、BL21（DE3）、Rosetta（DE3）感受态细胞、pET-24a-CYFP载体均由浙江师范大学化学与生命科学学院细胞实验室保存；含ERBS基因的载体pUC57-ERBS、寡核苷酸链由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性核酸内切酶Not I、Sal I、PCR相关试剂、T4 DNA Ligase等购自宝生工程（大连）有限公司；IPTG、氨苄青霉素、卡纳霉素、酵母提取物、胰蛋白胨均购自Oxoid LTD公司（Hampshire，England）；DTT、溶菌酶、Pepstatin A购自Amresco公司；PMSF为BBI产品；Ni-NTA His-Bind SuperflowResin购自Novagen公司；超滤管购自Millipore公司。其他常规生化试剂均购自国内公司，为分析纯。

1.2 构建载体所需引物

根据已知的基因序列，用Primer premier 6.0设计引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所用引物如表1所示。通过引物ERBS-F与ERBS-R进行PCR扩增，得到含有Not I、Sal I酶切位点的ERBS，从而将其构建到pET-24a-CYFP载体中。

3.1.2 清创 采用自溶性清创法进行清创［6-7］。严格执行无菌技术，以0.9%氯化钠棉球彻底清洗伤口，将坏死组织及脓性分泌物清除干净。水凝胶均匀涂抹于坏死区，无粘性泡沫敷料保湿覆盖，低敏宽胶带封贴［8］。第2天就诊时发现渗液中等量，黑色坏死组织变软并且部分脱落，按照保守性锐器清创指南使用无菌剪刀，用血管钳分离和提起坏死组织并剪除［5］。

表1 构建载体所用引物

1.3 合成寡核苷酸链

设计ERBS特异性识别并结合的寡核苷酸，5′加FAM荧光基团（表2）。

表2 合成的寡核苷酸链

1.4 方法

1.4.1 pET-24a-ERBS表达载体的构建设计可以结合5′-ACAGCGGC-3′的ERBS基因序列，合成于pUC57-SmalI；以pUC57-ERBS为模板，利用引物ERBS-F和ERBS-R扩增之后，其PCR纯化产物与pET-24a-CYFP质粒通过双酶切（Not I、Sal I）及割胶回收后，二者的割胶回收产物经16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α，酶切验证正确之后转化BL21（DE3），获得pET-24a-ERBS表达菌株。

1.4.2 BL21（DE3）中ERBS蛋白的表达挑取pET-24a-ERBS表达菌株单菌落至含4 mL LB培养基（含Kana抗性）的试管中，37℃220 r/min摇床振荡培养过夜。将试管菌液转移至500 mL LB培养基中扩大培养，培养至OD600为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，16℃诱导过夜后，离心收集菌体，使用磷酸钠溶液（pH＝8.0），加入pepstatinA、PMSF、溶菌酶，4℃裂解1 h，超声波破碎后离心，分离上清及沉淀，将样品处理后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.4.3 Rosetta（DE3）中ERBS蛋白的表达提取pET-24a-ERBS（BL21）质粒，转化Rosetta（DE3）。挑取单菌落至含4 mL LB培养基（含Kana抗性）的试管中，37℃220 r/min摇床振荡培养过夜。将试管菌液转移至500 mL LB培养基中扩大培养，培养至OD600为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，16℃诱导过夜后，离心收集菌体，使用磷酸钠溶液（pH＝8.0），加入pepstatinA、PMSF、溶菌酶，4℃裂解1 h，超声波破碎后离心，分离上清及沉淀，将样品处理后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

将破碎上清通过镍柱纯化，采用0、5、50、100 mmol/L咪唑梯度洗脱目的蛋白，蛋白电泳显示，100 mmol/L咪唑可以将目的蛋白完全洗脱下来，将100 mmol/L咪唑洗脱溶液进行透析获得的蛋白样品，利用3 ku超滤管低速离心浓缩蛋白。蛋白浓度根据Bradford法[20]测定。

1.4.4 光谱分析利用安捷伦Cary 4000紫外-可见-近红外分光光度计的Kinetic程序，在激发波长为494 nm、发射波长为521 nm的条件下，测定不同浓度的ERBS蛋白与5′-FAM标记寡核苷酸相互作用的吸光值，计算解离常数。

2 结果与分析

2.1 ERBS的基因序列（5'-3'）及其对应的氨基酸序列

以人的PUM1的RBD（G828-Y1168，PDB：1M8Y）为骨架，根据已经解析的RBD对应RNA的4种碱基的识别密码，设计ERBS的氨基酸序列，送至生物工程公司优化、合成大肠杆菌表达ERBS蛋白所需的核苷酸序列（图1），黄色区域为ERBS的8个RNA结合结构域，3′-5′依次结合RNA碱 基ACAGCGGC。

2.2 ERBS片段的获得

ERBS片段使用ERBS-F、ERBS-R引物通过PCR扩增得到，其扩增结果如图2所示，产物长度为1 000 bp左右，符合预期。割胶回收后酶切（Not I＋Sal I），然后连接到pET-24a-CEYFP载体上，通过菌液PCR筛选出阳性克隆，构建重组质粒载体pET-24a-CEYFP-ERBS。

2.3 蛋白纯化结果

2.3.1 BL21（DE3）中ERBS蛋白的表达结果为了分析ERBS与其对应核苷酸的特异性互作，将ERBS通过BL21（DE3）表达菌株进行表达，并收集其破碎上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果显示（图3），蛋白诱导成功但大多数蛋白都形成了包涵体存在于沉淀中，包涵体的纯化需要经过复杂的变性复性过程，给后续的试验造成了很大的麻烦。

2.3.2 Rosetta（DE3）中ERBS蛋白的表达结果为了获得可溶性的ERBS，提取pET-24a-ERBS（BL21）质粒，转化Rosetta（DE3）进行表达纯化，SDS-PAGE电泳结果显示（图4），蛋白诱导成功，且为可溶性蛋白，并且通过镍柱纯化之后得到了纯度较高的ERBS（≥95%）。

2.4 ERBS蛋白与寡核苷酸链的相互作用

为了分析ERBS与其对应核苷酸的特异性互作，利用镍柱纯化的ERBS和5′-FAM标记寡核苷酸（0.4μmol/L）结合ERBS后荧光强度发生改变这一特点，分析了ERBS与其目标寡核苷酸（底物）之间的解离常数（Kd）。利用0.4μmol/L的5′-FAM标记寡核苷酸链，分别加入不同浓度的ERBS（图5），激发波长为494 nm，发射波长为521 nm，根据寡核苷酸链荧光强度的变化拟合获得解离常数Kd。数据拟合分析发现，Kd为（9.76±0.62）nmol/L，与已发表数据（Kd≈0.5～30 nmol/L）一致。

3 结论与讨论

设计可以结合任意RNA序列的PUF蛋白具有许多潜在的生物和医学应用[26]。RNA复合体在调节基因表达方面具有很重要的作用，对多细胞真核生物的细胞分化和复杂的发育模式也是至关重要的[27-29]。但是蛋白质以何种方式结合RNA很难预测[30]，这限制了为生物技术和医学应用设计RNA结合蛋白[31]。RBP的潜能与siRNA和miRNA相似，然而，miRNA主要是降低靶RNA在细胞质中的丰富度或表达，这依赖于RNA干扰途径[32]。因此，设计RNA结合蛋白很吸引人，因为它们可以与任意感兴趣的结构域融合，选择性地结合于特定的RNA靶位点，进而监测或控制其代谢的任何方面。

人工设计PUF（Engineered PUF，EPUF）可以与任何靶RNA的几个碱基特异性地结合，招募其他蛋白因子形成功能性融合蛋白，从而调控mRNA剪切，影响蛋白质翻译和特定mRNA的稳定性。这些结果暗示，EPUF可以作为潜在的生物化学研究和生物医疗工具进行开发。

本试验为了分析ERBS与其对应核苷酸的特异性互作，通过Escherichia coli Rosetta（DE3）表达ERBS，并利用镍柱纯化获得ERBS，利用5′-FAM标记寡核苷酸（0.4μmol/L）结合ERBS后荧光强度发生改变这一特点，分别加入不同浓度的ERBS（激发波长为494 nm，发射波长为521 nm），根据5′-FAM标记寡核苷酸荧光强度的变化拟合获得解离常数。

Rosetta（DE3）补充6种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA），提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平[33]。试验也证明，使用Rosetta（DE3）之后，确实提高了蛋白的可溶性表达水平，有关如何提高外源基因可溶性表达的策略，仍需要进一步探索。