长尾仓鼠VKORC1基因的提取与扩增

杨新根，杨静，张建珍，郭红芳，王庭林，邹波，常文英，侯玉

（1.山西省农业科学院植物保护研究所，农业有害生物综合治理山西省重点试验室，山西太原030031；2.山西大学生命科学学院，山西大学应用生物学研究所，山西太原030006）

长尾仓鼠（Cricetulus longicaudatus Milne-Edwards）是我国华北旱作地区重要的农田害鼠之一，主要分布在河北、山西、内蒙古、陕西、甘肃、青海、新疆、西藏、四川等地。长尾仓鼠一般栖息于海拔较高的次生阔叶林地带和较干燥的荒地、灌草丛和农田等。根据山西省农业科学院植物保护研究所调查数据，在山西省，长尾仓鼠是大部分农田的优势鼠种（晋城、临汾、长治、吕梁、晋中、太原、忻州等地）[1-4]，有些区域其所占比例达到70%以上（晋中、太原、忻州等地），是制约山西省农业健康发展的重大害鼠。

目前，防治长尾仓鼠的主要药剂为杀鼠灵、溴敌隆、氟鼠灵等抗凝血灭鼠剂。此类灭鼠剂的作用机制是通过干扰维生素K的代谢，破坏鼠类的正常凝血功能而致其死亡[5-6]。抗凝血类灭鼠剂具有作用时间长（一般在鼠类食用3 d后致鼠死亡，不会引起鼠类的警觉）、相对比较安全、适口性好、灭鼠效率高等优点。因此，目前世界各国一般均采用此类药物对鼠类进行防控。但随着抗凝血杀鼠剂的广泛使用，鼠类抗药性种群开始在多个地区出现。自BOYKE[7]于1960年首次在英国的一家牧场发现褐家鼠对杀鼠灵产生抗药性以来，DODSWORTH[8]也于1961年在瑞典发现了小家鼠抗性种群的存在。此后陆续有许多西方国家发现了产生抗药性的“超级鼠”种群。

20世纪80年代，我国开始推广应用抗凝血杀鼠剂，并取得了比较满意的成果。但之后在我国的湖南、广东和上海等用药时间较久的地区开始出现抗药性害鼠[9-14]。据前人报道，黄胸鼠（Rattus tanezumi）对杀鼠灵的抗性率于2000年在长沙市达到了72.72%，1999年在湛江地区为17.7%，2003年在广州市为45.2%；另外，在2003、2004年的广东省不同市区，小家鼠（Mus musculus）对杀鼠灵的抗性率为27.8%～50.0%。同时，由于害鼠对抗凝血灭鼠剂的交叉抗性，而目前对于新药的研制又面临着难度大、周期较长的问题，所以，如果害鼠对第2代抗凝血剂产生了抗药性，鼠害的防治工作将变得更加困难。

有研究报道，啮齿动物维生素K的代谢主要依靠维生素K环氧化物还原酶（vitamin K epoxide reductase，VKOR），而编码VKOR的基因——维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1）基因突变可能导致VKOR活性抑制，进而阻断抗凝血杀鼠剂与VKOR的结合，使鼠类产生抗药性[15-19]。因此，应用分子生物学的手段，分析鼠类VKORC1基因的突变位点，预测编码蛋白结构，并且探究其对鼠类抗药性的影响，是近年来鼠类抗性研究领域的热点。

本试验拟对长尾仓鼠的VKORC1基因片段进行扩增并获得其序列，可为探究长尾仓鼠VKORC1基因与其抗药性的关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物试验鼠捕自山西省忻州市五台县，对每只鼠称质量、鉴定性别并编号。

1.1.2 主要仪器微量台式冷冻离心机5424R型，Eppendorf公司生产；T100热循环仪，美Bio Rad公司生产；电泳仪BG-Power6000型，北京省晶生物科技公司生产；干燥箱2XDP-B2120型，上海智诚分析仪器有限公司生产；灭菌锅G-I54DWS型，厦门致微科技公司生产；凝胶成像仪Alpha Imagertech型，美国Protein Simple公司生产。

1.1.3 主要试剂血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，北京天根公司生产；无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂生产；PCR试剂，北京天根公司生产；PCR引物，上海生工生物工程股份有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取采集长尾仓鼠尾尖作为DNA提取材料，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测有目标条带后，对其进行定量分析。

1.2.2 PCR扩增与测序

1.2.2.1 引物设计从GenBank中下载与长尾仓鼠亲缘关系较近的8种鼠的VKORC1基因序列（表1），应用GeneDoc软件比对8个序列，选择保守区域，应用PCR引物设计软件Primer Preimier 5.0设计引物，并确保扩增产物含有相互重叠的区域，分别长约700、600 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物设计中使用的8种啮齿动物VKORC1基因序列

1.2.2.2 PCR扩增以提取得到的长尾仓鼠全基因组DNA为模板，应用设计的引物进行PCR扩增。经多次试验优化反应体系，摸索出扩增条带较好的反应体系（表2）。

表2 PCR反应体系

PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53.1℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃5 min。采用2%琼脂糖凝胶检测是否有目标条带。

2 结果与分析

2.1 引物设计

使用GeneDoc软件对与长尾仓鼠亲缘关系较近的8种鼠的VKORC1基因序列进行比对（图1）。经过比对后选取其中较为保守的区域：引物1所选上游引物为660区域，下游引物为1380区域；引物2所选上游引物为820区域，下游引物为1430区域。经PCR引物设计软件Primer Preimier 5.0设计出2对引物（表3）。

表3 PCR使用的引物

2.2 扩增产物检测

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到目标条带（图2）。

扩增产物检测使用的DL 5000 Marker（图2），在500～750 bp的条带即为目标条带。本试验以长尾仓鼠的全基因组为模版，与特异引物进行结合，扩增出了长度700、600 bp的条带。条带与预测基因片段大小一致，为目标条带。

3 结论与讨论

目前，随着分子生物学的高速发展，PCR技术与引物设计所涉及到的各种软件也得到了相应的大力开发。同时，公共的数据库可提供大量的生物信息学数据。科研工作者可以通过BIOSINO、Gen-Bank等开放的数据库，便捷地获得目标生物信息，并由此应用相应软件设计引物以获取目标条带，提高测序和分析效率[18]。本研究能够获得长尾仓鼠VKORC1基因片段，探究长尾仓鼠VKORC1基因与其抗药性的关系，正是基于分子生物学各项技术的长足发展及上述公共数据库的建立健全。

啮齿动物的抗药性表现在多个方面，包括行为抗性、生理抗性和遗传抗性等。其中，抗性种群体内维生素K环氧化物还原酶VKOR的活性抑制是鼠类对抗凝血灭鼠剂产生遗传抗性的主要原因之一[19]。作为编码VKOR的重要基因，VKORC1的突变与否，是啮齿动物对抗凝血杀鼠剂是否产生抗性的重要指标之一。因此，探究啮齿动物的VKORC1基因，探索抗药性监测新途径，对于控制抗性蔓延、降低鼠害程度具有重要意义。