基于荧光素酶活体成像筛选转基因玉米植株的条件优化

常利芳，白建荣，李锐，闫蕾，郝曜山，杨瑞娟，康晨

（山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

在植物分子生物学研究中，目的基因或启动子的功能研究都必须通过转基因植物纯系鉴定和分析。因此，从大量的转化后代个体中获得高表达的转化植株是进行这些研究的前提。用传统方法筛选理想的转化体及纯系需要耗费大量人力、物力和财力，而应用报告基因则可以提高转基因植株检测的效率[1-2]。报告基因（reporter gene）通常是指应用编码催化人工底物产生颜色变化，且表达产物容易被检测的基因。目前，转基因植物检测常用的报告基因有荧光素酶基因（LUC）、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）和绿色荧光蛋白基因（GFP）等[1-3]。这些报告基因系统中，GUS基因是通过离体染色进行鉴定，虽然成本低，但步骤多、时间长、灵敏度差，而且植物中存在内源GUS和GUS抑制子[4]。GFP和LUC基因都是通过检测生物体中的荧光信号检测目的基因，但GFP基因在检测时需要激发光，虽然灵敏度高，但是信噪比低，所以，检出效率低[3，5-8]。萤火虫荧光素酶基因是从萤火虫中分离出来的发光基因，该基因产生的荧光素酶与底物结合后产生酶促反应，本身可以产生荧光，不需要激发光，具有其他报告基因不可替代的优势，即快速简单、特异性强、无毒无放射性、灵敏度高、信噪比高等。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，成为高效检测基因表达和启动子的常用方法[9-16]。

随着分子生物学技术的发展，在不破坏生物体组织的前提下，采用活体成像技术检测生物体的荧光信号，具有操作简单、直观、灵敏度高的优点，被广泛应用于生命科学、生物医学及药物研发等方面[17-18]，但是作为检测转基因植株的手段的应用研究还比较少[16，19-20]，目前还没有见荧光素酶基因作为报告基因在主要粮食作物转基因植株鉴定中的应用。

本研究利用植物活体成像系统检测玉米转基因植株的荧光素酶基因信号，建立和优化整株转基因植株的荧光素酶活体检测体系，为玉米转基因后代植株的筛选鉴定提供简便、快速、准确、低成本的方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为玉米自交系郑58和以郑58为受体的荧光素酶转基因T1种子，均由山西省农业科学院作物科学研究所保存。包括2017年在山西省农业科学院东阳日光温室采用花粉管转基因技术转化玉米受体郑58，共获得转化35S-Luciferase-NOS的T1种子66粒；转化Ubiquitin-Luciferase-NOS的种子68粒。D-萤火虫荧光素酶底物购自北京融京科技发展有限公司。

1.2 仪器

德国Berthold公司生产的植物活体成像系统Night SHADE LB 985采用仪器自带的IndiGo软件进行图像处理及分析。

1.3 试验方法

1.3.1 植株培养2018年6月，在山西省农业科学院分子生物共享实验室，以玉米自交系郑58作为对照，与T1转基因种子一起消毒清洗后，单粒种于装有10 mL MS培养基的50 mL离心管中，置于28℃培养箱中培养4～5 d。

1.3.2 活体成像系统检测参数的设置将培养好的植株幼芽取出，用清水洗去根部的培养基，将幼芽放在加了碳素墨水的黑色琼脂糖凝胶平板上，喷施15 mg/mL D-荧光素酶底物，放入Night SHADE LB985植物活体成像系统暗箱平台，静置反应2 min后，打开IndiGo软件设定不同的拍照参数，拍照比较曝光时间2 min、像素合并值binning 4×4和曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8的成像效果。

1.3.3 玉米植株的大小选择设置3组大小的玉米植株，第1组：玉米幼芽小于1 cm；第2组：玉米幼芽3～8 cm；第3组：两叶期的玉米幼苗。

1.3.4 成像信噪比值以植株荧光最高点的信号值作为该株的信号值，待测植株信号值与对照植株信号值均减去背景信号值后的比值作为信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）。

2 结果与分析

2.1 活体成像系统参数的确定

由图1可知，在曝光时间2 min、像素合并值binning 4×4时，玉米幼芽的信号最高值为124 cps，而曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8时，幼芽的信号值为1 736 cps，灵敏度更高，适合于玉米幼芽的检测。

2.2 确定玉米植株的大小

在曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8条件下，分别比较了玉米芽和两叶期幼苗的荧光信号。结果发现，在芽长小于1 cm时无法检测到荧光信号；3～8 cm的幼芽可以检测到明确的信号，最高值为936 cps；而两叶期幼苗的背景信号过强，并且底物无法被叶片吸收，无法检测到信号（图2）。多次试验后，最终确定28℃恒温发芽4～5 d、3～8 cm玉米幼芽用于活体系统检测。

2.3 根据信噪比值鉴定转基因玉米植株

按照2.1、2.2优化后的条件对转基因T1植株进行检测，初筛结果显示，转化35S-Luciferase-NOS发芽种子66株中，11株有荧光信号；转化Ubiquitin-Luciferase-NOS的发芽种子68株中，30株有荧光信号。进一步对这11株和30株分别进行单株复检，其中，35S-9和35S-10信噪比值均大于2.0，分别为2.32和2.56；UB-1、UB-6、UB-11、UB-13、UB-21、UB-27信噪比分别为9.75、10.63、5.69、11.00、5.06和3.81，均大于2.0，其他植株的信噪比都小于2.0，35S-10植株的检测结果如图3所示。可以认为信噪比大于2.0的植株为强表达阳性植株。

3 结论与讨论

萤火虫荧光素酶基因（LUC）以不破坏植株、背景低、信噪比高等优点可作为高等植物遗传转化的可视化标记。荧光素酶在底物存在的条件下发生酶促反应，但前人多使用荧光检测仪、荧光光子计数器通过体外细胞或组织发出荧光的相对荧光光子数来分析荧光素酶基因的表达情况，操作复杂，而且大量的人为操作使精确性降低[13-15]。有研究者用荧光成像仪检测带有荧光素酶基因的拟南芥的功能，但是只是用白光和荧光下的对比进行定性判断，用色标度的颜色反映基因表达的强弱[19-20]。也有用色标度简单地将有信号的植株分为无、弱、中等、强和较强5个级别进行定量分级的报道[16]。本研究表明，在曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8条件下，以培养3～8 cm的玉米幼芽为材料，能够较好的检测到植株荧光素酶信号。同时，为了更加准确的判断阳性植株，本研究引入信噪比的概念进行定量检测，将待测植株与对照同时拍照，将二者的信号峰值分别减去背景值后的比值作为判断标准，并确定信噪比值大于2.0的植株为强表达阳性植株。该优化的检测体系降低了检测的假阳性和外源基因表达较弱的植株，能够更加准确、直观、快速和有效的筛选玉米遗传转化中的阳性植株，提高转基因植株的筛选和鉴定效率。