尿道组织工程的进展研究

张左 程帆

男性尿道兼具排尿和排精功能[1]。由于先天畸形或后天损伤、疾病等原因导致尿道损伤或狭窄。目前,处理尿道狭窄的方法包括尿道扩张、尿道切开术或者更具侵入性的操作比如吻合尿道成形术和替代尿道成形术[2]。对于广泛和严重的病人，这些方法常常不能解决问题而需要做移植物替代。在移植物短缺的情况下，组织工程技术可能成为解决这一情况的可行的解决方法。本文将从尿道组织工程的细胞来源、材料和方法等进行综述。

一、支架材料

理想的支架材料应该提供有利于细胞增殖、迁移和再组织化的多孔环境，拥有适当的拉伸强度和刚性以防新生组织完全形成之前出现崩塌，且支架经过一段时间能够完全分解和再吸收，以及没有或有较低的免疫原性、毒性和异物反应。此外，支架材料应当具备适当理化性质能在常规灭菌条件下进行灭菌使用。尿道重建材料包括天然材料和合成高分子材料两大类。

1.生物支架：天然支架既可以是供体通过物理或生化方式脱细胞处理得到的脱细胞组织，也可以是利用胶原、弹性蛋白等天然材料编织而成的生物工程补片[3]。尿道修复重建中常用的脱细胞基质有小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)、膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrices,BAM)、裸人羊膜支架(denuded human amniotic scaffold,dHAS)和脱细胞海绵体基质(acellular corpus spongiosum matrices,ACSM)等。脱细胞支架有许多优点，如保持原有组织的微观结构和细胞外基质生化成分(包括胶原、弹力蛋白、层黏连蛋白、一些重要的生长因子和生物活性物质)，其缺点在于难以控制结构强度和理化性质，这些特点与植入尿道后发生纤维化和挛缩相关[4]。Chun等[5]利用脱细胞膀胱黏膜下层基质(bladder submucosa matrix,BSM)与自体尿道组织联合治疗兔长段尿道狭窄，BSM/自体尿道组织移植组具有正常的尿道内腔，致密的肌层，完全上皮化和再生尿道内血管渐进性浸润。BSM移植组则显示角质化上皮，大量胶原化纤维结缔组织，缺乏环状平滑肌束。因此，采用脱细胞BSM支架与自体尿道组织移植相结合的非横切腹侧嵌套尿道成形术是一种可行的尿道重建方法。除了脱细胞补片外，支架还可以由天然材料制成，因其形状和构成与所选材料的细胞外基质类似。胶原是最常用的材料，其他材料还有丝素蛋白、藻酸盐等。精确且优化设计支架的各种性能(包括基质的选择、纹理和孔隙率等)对于在不减少细胞种植和存活率的情况下取得满意的结构强度显得至关重要[6]。

2.合成支架：相较于天然支架，合成支架具有较低的成本，获取便利，伦理学风险更低。合成支架可以根据孔隙尺寸、构成以及是永久性还是可吸收的进行区分。目前制造合成支架有多种方法，包括针织、机织、电纺织、3D打印、沉淀法和注射成模等[7-8]。转化生长因子(TGF)-β通过调节WNT信号通路促进细胞外基质的分泌，Zhang等[9]利用递送WNT通路抑制剂ICG-001的胶原/PLCL支架用于尿道成形术以及抑制细胞外基质(ECM)体内体外表达可行性研究，发现该负载有ICG-001的胶原/PLCL复合支架能够促进成纤维细胞减少ECM沉积。

3.3D生物打印技术：可以精确设计复杂且个体化的支架[10]。3D生物打印机可以对活细胞、合成聚合物和生物材料进行高分辨率定位控制，从而能精确重现特定的组织微结构。生物打印技术已经显示出在再生医学领域中具有产生各种可移植组织(包括皮肤、软骨和骨骼)潜在用途。Zhang等[11]一支国际联合团队首次证明3D生物打印技术应用于尿道结构的可行性。

4.细胞片层工程(cell sheet engineering，CSE)自2004年由Oka等[12]提出以来已经频繁应用于再生医学领域，包括肾脏病学和泌尿外科方面。细胞片层是用温度敏感培养皿制备的：温敏聚合物聚异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropyl acrylamide，PIPAAm)通过共价方式结合到培养皿上，使得多种细胞在37 ℃时黏附和增殖；当温度降到32 ℃时，不需要水解酶，细胞即会自发分离。国内傅强教授领导的小组应用细胞片层技术制备组织工程仿生尿道并利用超小型超顺磁氧化铁(ultra small super-paramagnetic iron oxide，USPIO)标记技术进行全层尿道重建。收集少量的口腔和脂肪组织，分离出脂肪干细胞、口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞用于制备细胞片层，然后逐层将细胞片层制成三层管状组织工程尿道并用USPIO进行标记以供后期使用磁共振成像(MRI)进行检测。接着将管状尿道植入皮下3周以促进再血管化和增强生物机械强度。最后进行为期3个月的组织工程仿生尿道替代实验。组织学实验结果显示，取出的仿生尿道仍然具有上皮层、纤维层和肌层的三层结构；免疫荧光分析表明，仿生尿道的血管密度在植入皮下3周后显著提高，并且3个月后恢复到与植入前正常尿道组织相近。这些结果表明，细胞片层技术具有使三层仿生尿道在结构和功能上接近原始尿道组织的潜力。

二、种子细胞

多种自体细胞经过体外培养和增殖后种植到支架上用于修复损伤和狭窄尿道，这些细胞包括尿道上皮细胞、平滑肌细胞、上皮祖细胞以及从脂肪或骨髓中提取的干细胞等。研究人员已经开发了几种细胞种植方案以最大程度优化细胞存活，增殖和分化。目前，通过灌注或旋转生物反应器进行动态培养的方案优于静态技术进行细胞种植，因为它们可以更好地模拟生理环境以促进氧和营养物质的均匀分布，并使细胞承受与生理组织相似的机械力和应力[13]。

1.祖细胞：细胞存在于多种组织类型中，其主要作用是补充因为生理更替、衰老或损伤而丢失的细胞以恢复组织稳态。祖细胞的特征是有限的自我更新能力和单分化潜能，其中常见的有上皮细胞和平滑肌细胞[14]。(1)上皮细胞：上皮细胞包括自体尿道上皮细胞、表皮细胞和口腔角质细胞。一般尿道上皮细胞是从膀胱黏膜取活检获取的，常用于尿道和膀胱重建。也有研究人员从膀胱冲洗和尿液中收集尿道上皮细胞。从尿液中收集的细胞特征类似于膀胱细胞并且有望用于尿道组织工程。自体表皮细胞可从阴茎包皮获取，除非病人已经做了包皮环切术或其他手术。实验中将这些细胞接种于脱细胞胶原基质然后植入兔尿道，尿道造影显示尿道没有任何狭窄迹象且组织学亦提示移行细胞层。口腔角质细胞如颊黏膜角质细胞和舌黏膜角质细胞也可作为上皮细胞来源。颊黏膜具有非角化复层鳞状上皮，对机械磨损有更大的耐受弹性。活检取样虽然也会造成一定损伤，但和膀胱或尿道黏膜活检取样相比损害要小得多。(2)平滑肌细胞：自体平滑肌细胞不仅有助于血管生成和上皮组织成熟，而且还具有改善细胞外基质顺应性和组织弹力的潜力。Feng等[15]利用自体舌角质细胞和海绵体平滑肌细胞种植于猪脱细胞海绵体基质形成3D新尿道组织修复尿道缺损。实验结果表明，种植海绵体平滑肌细胞可促进表皮层生长，改善血管分布以及促进自体平滑肌细胞渗入生物材料使移植物的生物机械性能得到提升。

2.干细胞：干细胞是有自我更新潜力的一类细胞，他们能分化为成熟的非再生细胞或效应细胞[16]。一般来说，干细胞比祖细胞未分化程度低，分化潜力更高，其主要特征是自我更新能力和多分化潜能。干细胞可以作为尿道组织工程或膀胱组织工程的细胞成分来源，尤其是当机体因膀胱疾病或恶性膀胱而无法获取祖细胞时[17]。尽管有许多研究表明，胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是可以分化为尿道上皮细胞的，但是出于伦理学顾虑、潜在恶性和细胞管理等问题的考量，胚胎干细胞的应用目前仍然受到限制[18]。由于存在这些限制，研究人员试图利用成体干细胞(adult stem cells，ASCs)作为替代尿道重建的细胞来源[19]，因为ASC具有促血管生成、抗纤维化和免疫抑制等特性以及在适当条件下分化为所有细胞系的能力。间充质干细胞来源包括骨髓、脂肪组织、肝脏和血液组织等。骨髓干细胞在离体条件或在体条件下均可以分化为尿道上皮和膀胱干细胞。Tian等[20]用共培养和条件培养方案成功将人骨髓间充质干细胞分化为尿道上皮样细胞和平滑肌样细胞。该研究小组还证实了几种关键生长因子在共培养中的作用，包括肝细胞生长因子，血小板生长因子B链同源二聚体，转化生长因子和血管内皮生长因子等。然而，获取骨髓间充质干细胞需通过有创的骨髓穿刺，这也就限制了其临床应用。相反，脂肪干细胞可以通过吸脂术大量获取且其分化潜能已经得到广泛研究。人脂肪干细胞可以通过添加全反式维甲酸或与尿道上皮细胞共培养分化为尿道上皮细胞[21]。Moreno-Manzano等[22]发现，在植入新膀胱10天后，含有脂肪来源间充质干细胞(ADSC)的基质促进了成熟p63和细胞角蛋白7阳性的尿道上皮显著恢复。在ADSC基质中，波形蛋白中胚层标志物在黏膜下层有明显的诱导表达。有趣的是，研究者发现在横向和纵向平滑肌层中，ADSC基质中平滑肌肌动蛋白的表达更高。此外，CD31和S100β反应性的分布分别决定了ADSC新膀胱血管化和神经支配的增加。尿源性干细胞的特征包括拥有较长的端粒和较活跃的端粒酶，他们能够分化成多种细胞系并在细胞膜上表达若干种间充质干细胞标志物[23]。通过适当的方式进行诱导分化，尿源性干细胞可以分化为多种膀胱相关细胞，包括功能性尿道上皮细胞和平滑肌细胞[24]。

三、生长因子

多种生长因子对于组织再生起着重要作用。天然支架如SIS和BAM保留着原有的细胞外基质，即使经过处理也仍然能够维持其特有分子构成并能表达相应的生长因子，包括TGF-β和VEGF[25-26]。Jia等[27]研究发现，VEGF修饰的胶原支架对比格犬模型中5cm长尿道缺损的矫正效果。术后6个月，VEGF结合的新尿道相比对照组(没有结合VEGF的胶原支架)管腔明显增大，纤维化程度降低且血管化程度增强。除了生长因子外，小分子也常作为添加成分以达到增加支架移植成功率的作用。如，通过调节TGF-β通路抑制过度纤维化[9]。张楷乐等评估了兔尿道狭窄模型中小分子ICG-001对WNT通路的潜在抑制作用。通过核壳共轴静电纺丝技术，他们制备了一种Ⅰ型胶原-聚混合尿道支架，且负载有ICG-001分子。在药物递送支架释放的培养基处理后，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和成纤维细胞的纤连蛋白的表达在mRNA水平和蛋白质水平受到显著抑制。

四、结语

基于细胞和可吸收支架的尿道组织工程在未来较长一段时间内将占有重要地位，异体细胞或许也能成为潜在细胞来源。生物活性细胞因子在组织工程中的作用有限，因为移植细胞可以产生多种细胞因子。组织工程尿道成形术是再生医学领域的一种比较切实可行的方法，它可以用真正的组织替代技术来取代传统的手术组织转移技术。大规模临床研究将有助于提高尿道重建组织工程的安全性和可靠性。