植物含跨膜域RING E3泛素连接酶研究进展

孙林静 张融雪 苏京平 王胜军 佟 卉 刘燕清 孙 玥

(天津市农作物研究所，天津 300384)

泛素蛋白酶途径在真核生物中是非常保守的，这个途径由泛素活化酶E1 (ubiquitin activating enzyme) 、泛素结合酶E2 (ubiquitin conjugating enzyme) 和泛素连接酶E3 (ubiquitin ligase enzyme) 协同工作。E1通过ATP依赖的方式与泛素共价结合，E2接受E1提供的泛素并与E3互作，E3识别并结合底物蛋白，然后将泛素转移给底物蛋白，形成底物蛋白单泛素或者多泛素化[1]。

1 TMD-RING在植物生理过程中的作用

1.1 TMD-RING在非生物胁迫中的作用

AtATL78表达受低温诱导但受干旱抑制，是一个膜定位RING泛素连接酶，删除其跨膜域后定位于细胞质，具有体外泛素连接酶活性，AtATL78 RNAi植株对低温的耐受性增强，但是对干旱的耐受性减弱[2]。

GhSARP1 是一个定位于质膜的C3H2C3类型的E3泛素连接酶，具有体外E3连接酶活性。GhSARP1在花后24、27和27DPA的叶片、花和纤维中转录水平较高，在根和茎中转录水平较低。GhSARP1的表达被盐、低温和ABA下调。过表达GhSARP1的转基因拟南芥在萌发和萌发后阶段对盐胁迫敏感，这表明GhSARP1可能负调控棉花中泛素化介导的盐胁迫反应[3]。

BnTR1是N末端具有2个跨膜域的C4HC3蛋白，具有体外泛素连接酶活性。在油菜和水稻中过表达该基因，增强了转基因植株对热胁迫的抗性。BnTR1可能通过调节钙通道的活性参与调控钙离子动态，进而诱导热击转录因子和热击蛋白表达量上调，从而正调控植物热胁迫耐受性[4]。

OsHIR1是定位于质膜和细胞核的C3H2C3类型RING泛素连接酶，其表达受到砷和镉诱导。在拟南芥中过表达OsHIR1能增强转基因植株对砷和镉的耐受性，OsHIR1能与OsTIP4;1相互作用，并通过26S蛋白酶体介导其降解，减少转基因植株对砷和镉的吸收从而增强对重金属耐受性[5]。

AtSTRF1是定位于质膜和细胞内小体的RING蛋白，受盐胁迫诱导表达。该基因的缺失突变体幼苗根部的内吞加速，膜转运系统相关基因表达量改变，对盐、离子和渗透胁迫耐受性增强，在盐胁迫下的活性氧积累减少。蛋白转运抑制剂BFA(brefeldin A)处理突变体后，BFA小体数目增加，结果表明AtSTRF1是一个膜转运相关泛素连接酶，能够调节盐胁迫下内膜蛋白转运和活性氧的产生[6]。

AtCHYR1含有1个CHY锌指蛋白结构域和1个RING结构域，定位于细胞质、细胞核和内质网。AtCHYR1受ABA和干旱诱导表达，主要表达在维管束和气孔中。AtCHYR1促进ABA诱导的气孔关闭和活性氧产生，增强植物耐旱性。SnRK2.6能够磷酸化AtCHYR1的178位苏氨酸，该磷酸化位点的破坏能导致AtCHYR1功能丧失[7]。PeCHYR1是AtCHYR1的同源基因，定位于细胞核和内质网，也受ABA和干旱诱导表达。过表达PeCHYR1的转基因杨树H2O2产生显著增强，气孔孔径减小。与野生型对照相比，转基因株系对外源ABA表现出更高的敏感性。此外，PeCHYR1的上调促进了气孔的闭合，减少了蒸腾作用，使得水分利用效率显著提高，并维持较高的光合活性和生物量积累。这些结果表明，PeCHYR1通过ABA诱导H2O2的产生导致气孔关闭，在提高抗旱性方面起着至关重要的作用[8]。

AtSPL1含有2个跨膜域和1个C3HC4类型RING结构域，定位于线粒体和过氧化物酶体，该基因突变体导致过氧化物酶体β氧化活性下降，SPL1降低了SP1诱导PEX13的翻转能力[9]。

MfSTMIR含有1个跨膜域和1个C3H2C3类型RING结构域，定位于内质网。MfSTMIR表达受盐、干旱和衣霉素诱导表达。在拟南芥和苜蓿中过表达MfSTMIR均能增强转基因植株的盐胁迫耐受性，内质网胁迫相关分子伴侣BiP1/2和BiP3的表达量在过表达植株中上调表达。进一步研究表明，在过表达MfSTMIR的截形苜蓿中，MfSTMIR能与内质网定位的泛素结合酶MtUBC32以及内质网蛋白转运通道亚基MtSec61γ相互作用，并且不影响互作蛋白的稳定性。在烟草瞬时表达系统中，MfSTMIR能够促进ERAD相关底物MtCPY*的降解。上述结果表明MfSTMIR可能通过与MtUBC32和MtSec61γ相互作用，以ERAD方式清除内质网错误折叠蛋白来缓解盐胁迫对植物的损害[10]。

AtXBAT35.2是定位于高尔基体的RING蛋白，该基因功能缺失增强了对盐和干旱胁迫的耐受性，而过表达增加了敏感性，这与XBAT35.2介导ACD11的蛋白酶体依赖降解一致。这表明在非生物胁迫下，ACD11高表达能增强植物耐性，当XBAT35.2积累进而促进ACD11的降解，从而降低了胁迫耐受性[11]。

1.2 TMD-RING在植物激素信号通路中的作用

XERICO (Greek for drought tolerant ) 是一个含有N末端跨膜的RING-H2类型泛素连接酶，过表达XERICO拟南芥抗旱性增强但是对高盐和渗透胁迫敏感；ABA合成途径关键酶NCED3表达量上调，ABA合成量增加，ABA响应基因显著上调表达。XERICO能与AtUBC8和AtTLP9 (TUBBY-like protein 9) 相互作用，AtTLP9是多亚基RING泛素连接酶的底物识别因子F-box，可能将XERICO作为底物蛋白识别，还有可能是被XERICO作为底物识别，这些有待进一步研究证明[12]。

以上非生物胁迫相关的SDIR1、AIRP1、AIRP3、RHA2a和RHA2b均参与了ABA信号途径。AtRSL1 (RING finger of seed longevity 1) 是质膜定位的C5HC2类型的RING泛素连接酶，C末端含有一个跨膜域，能与ABA受体PYL4和PYR1在质膜上相互作用并促进这两个受体的降解。过表达RSL1植株对ABA不敏感，而RSL1的RNAi植株对ABA超敏感，转基因植株对ABA的响应也发生了改变[13]。

XBAT35在植物中是ABA反应的正调节因子，通过VPS23A/PYL4复合物发挥作用，特别是通过加速VPS23A的周转，从而增加ABA受体PYL4的积累[14]。

1.3 TMD-RING在植物防御反应中的作用

拟南芥RING1具有多个跨膜域，定位于质膜脂筏。正常条件下RING1表达量在各个组织中比较低，当病原菌侵染或者PCD诱导剂FB1 (Fumonisin B1) 处理能够诱导该基因表达，利用RNAi技术降低该基因表达可以导致转基因植株对FB1超敏感[15]。

拟南芥ATL9是一个内质网定位的RING泛素连接酶，植物防御反应相关激素如水杨酸和茉莉酸不能诱导该基因表达，但是几丁质可以诱导，并且这种诱导依赖NADPH氧化酶。对atl9突变体转录组进行分析，结果显示几丁质信号途径和几丁质诱导的防御反应相关基因可能是ATL9的下游基因，ATL9可能参与了内质网胁迫相关降解过程[16]。

辣椒中的CaRING1受无毒性的野油菜黄单胞菌诱导表达，含有一个N末端跨膜域和C末端RING finger，定位于质膜并具有泛素连接酶活性。病毒诱导CaRING1沉默并使植物超敏反应受损，增加植物对辣椒疮痂病菌的感染，在拟南芥中过表达CaRING1可增强植株对丁香假单胞菌番茄致病变种的抗性[17]。

AtXBAT35.2是定位于高尔基体的RING蛋白，参与细胞死亡诱导和病原体反应。研究发现，在烟草叶片中过表达XBAT35.2，会触发细胞死亡，而且这种方式需要其RING结构域。XBAT35缺失突变破坏了植物抵御病原体攻击的能力，而XBAT35.2基因的过表达增强了植物对病原体的抵抗力。XBAT35.2能够自身降解，接种丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的毒株和无毒株后，则阻止这种降解。XBAT35.2在植物中与防御相关的ACD11相互作用，并促进其降解，用蛋白酶体抑制剂处理转基因幼苗会导致ACD11的积累，这表明XBAT35.2在诱导细胞死亡和防御病原体方面起作用[18]。

1.4 TMD-RING在植物养分代谢和转运中的作用

AtATL31定位于质膜，在植物碳氮代谢平衡和感知方面起作用。过表达ATL31的转基因植株在碳氮平衡失调时仍然能够正常萌发并生长。ATL31能与14-3-3χ相互作用并使之泛素化降解， 14-3-3χ的缺失突变体与过表达ATL31类似，这表明ATL31通过调控14-3-3χ蛋白积累量参与植物碳氮代谢感知[19]。

AtSIS3是含有3个跨膜域的C3H2C3类型RING泛素连接酶，具有体外泛素连接酶活性，sis3在外源添加高浓度葡萄糖时仍然能够萌发，但是对外源ABA的响应与野生型类似。这表明SIS3仅在葡萄糖信号通路中起作用，不参与ABA信号转导[20]。

AtATL15是一个N末端具有跨膜域的RING泛素连接酶，能够影响拟南芥对蔗糖的信号响应。蔗糖诱导ATL15的下调表达，ATL15定位于质膜和内膜系统。进一步的遗传分析表明,atl15敲除突变体对高蔗糖浓度不敏感, 而ATL15过表达抑制植物生长。此外, 内源性葡萄糖和淀粉量在atl15敲除突变体和ATL15过表达植株中均受到影响[21]。

AtLOG2 (Loss of GDU2) 主要定位于质膜，能与同样定位于质膜的GDU1 (Glutamine dumper1) 相互作用，并且二者的组织表达都位于木质部和韧皮组织，AtLOG2通过与GDU1的相互作用调控了植物细胞氨基酸的外向转运[22]。

OsNLA1是定位于质膜的RING类型泛素连接酶，能够介导磷转运蛋白OsPT2/PT8的降解，OsNLA1的突变体导致叶片磷浓度增加，并且是非氮素依赖型的。OsNLA1与泛素结合酶PHO2没有相互作用，PHO2不是OsNLA1介导OsPT2/PT8的E2[23]。

2 结论与展望

目前对膜定位的泛素连接酶有一些研究报道，但对比预测膜定位的泛素连接酶数量，已知功能的基因还是相对较少的，对此在今后的研究中需要关注以下几个方面的研究。首先是TMD-RING E3泛素连接酶底物的鉴定，相比核定位蛋白，膜蛋白的互作蛋白更难以筛选，可以通过去除跨膜域或者利用分裂泛素酵母双杂交系统进行底物筛选鉴定，并且通过双分子荧光互补、免疫共沉淀等实验进一步验证筛选到的互作蛋白的真实性。第二方面是叶绿体及线粒体等细胞器膜定位的TMD-RING E3泛素连接酶的报道较少，对于此类亚细胞定位的E3泛素连接酶的功能应予以关注。第三方面，对于TMD-RING E3泛素连接酶在干旱、盐、低温等非生物胁迫下或者是病菌侵染条件下，亚细胞定位是否发生改变也应当予以关注，因为定位的改变直接影响功能。第四方面，TMD-RING E3泛素连接酶在非生物胁迫方面的功能研究较多，而其他功能方面研究也应当予以关注。细胞膜对细胞的生理过程具有重要作用，应当对含有跨膜域的RING E3泛素连接酶进行更多的研究，以揭示其功能，了解更多的作用条件模式，以丰富对细胞生化过程的调节认知。