TLR4在新生儿坏死性小肠结肠炎中的研究进展

王燕燕 吴 瑾

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所 上海市小儿消化与营养重点实验室（上海 200092）

新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿期最常见的胃肠道急症，在疾病早期通常没有明显的临床症状，且发病机制尚未完全明确，导致其在早产儿中具有较高的患病率和死亡率，因此对NEC 的具体发病机制进行深入探索具有重要的临床意义。目前研究表明，先天性免疫系统和适应性免疫系统异常都可能与NEC 发生相关。模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）是固有免疫系统中的重要成分，PRR 作为一种保守受体，可以识别感染和损伤过程中释放的致病因子和内源性分子，并激活免疫应答[1-3]。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）是一类典型的模式识别受体，可以直接识别并结合病原体相关分子模式，引发下游信号转导，导致炎性细胞因子和趋化因子的释放，在机体的天然免疫防御中发挥着重要的作用[4]。TLR4是TLRs家族中识别病原微生物的重要成员，是介导革兰阴性菌细胞壁主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）应答的最主要受体，TLR4广泛分布于多种细胞中，肠上皮细胞和固有层免疫细胞表面表达的TLR4被认为是NEC炎症反应链的起始点和重要调控点[5]。本文将从TLR 4诱导肠道细胞凋亡、抑制杯状细胞分化及导致肠黏膜内淋巴细胞失衡等方面作一介绍，总结关于TLR4表达异常在NEC发病过程中所起作用的相关研究进展。

1 在NEC发病过程中的表达变化及其作用

TLRs是固有免疫应答中的一种模式识别受体，人类已经发现的TLRs家族成员有10个，小鼠中有13个。TLRs广泛表达于多核细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞以及自然杀伤细胞等免疫细胞以及上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等非免疫细胞中，并分布于质膜表面或内体中[4]。TLR4是第一个在哺乳动物的天然免疫细胞中被发现的TLRs[6]。研究表明，肠上皮细胞和固有层免疫细胞中的TLR4信号转导通路异常活化与NEC的发生密切相关[1]。在早产儿的不成熟肠道中，TLR4表达显著升高，导致细菌定植时肠道对应激源产生过度活跃的反应[7]，并引起肠上皮细胞凋亡增加、增殖和迁移减少，最终导致肠上皮的破坏[5,8]。同时，血管内皮细胞的TLR4信号转导通路被激活，通过一氧化氮合酶的减少导致一氧化氮（nitric oxide，NO）合成减少，引起血流障碍和肠缺血[9]。与野生型小鼠相比，在TLR4变异小鼠中诱导的 NEC严重程度显著降低，而暴露于脂多糖和缺氧则会导致小鼠肠上皮细胞TLR4表达增加，TLR4信号激活导致肠上皮细胞凋亡增加，从而加重NEC的肠道损 伤[10]。

2 介导的炎症-凋亡信号通路在NEC 发病机制中的作用

2.1 TLR4-MyD88/TRIF信号通路的作用

在NEC病程中，由于肠上皮细胞凋亡异常而导致的肠道菌群移位是导致感染及致死的主要原因。革兰氏阴性杆菌是肠道菌群移位的主要细菌，在哺乳动物细胞内，其胞壁外膜的主要成分LPS的信号转导主要通过TLR4进行。TLR4与配体LPS结合后，可引起下游核因子NF-κB（nuclear factor-κb，NF-κb）活化，导致下游多种炎症因子释放，同时还可以诱导凋亡[11]。NEC 发生时肠道细胞凋亡增加，肠道凋亡率与肠道组织损伤程度呈正相关[12]。TLR4通过下游的两条信号通路促发炎症和细胞凋亡，一条通过髓样分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）介导，另一条通路是TRIF（TIR domain containing adaptor inducing interferon β，TRIF）依赖性信号通路，也被称为MyD88非依赖信号通路[13]。

MyD88是TLR4信号通路下游第一个衔接蛋白，其通过激活下游核转录因子NF-κB，导致肠上皮细胞释放白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）及IL-1β等促炎因子，从而促进肠上皮细胞的凋亡。在MyD88基因敲除小鼠中用LPS诱导NEC，与野生型小鼠NEC相比，其肠道炎症程度减轻，肠道细胞凋亡率降低，提示MyD88是NEC炎症发生过程中的重要调控因子之一[12]。研究发现，乳脂球膜可以通过抑制TLR4信号通路中的TLR 4、MyD 88 蛋白表达及NF-κB 磷酸化水平，减轻NEC的肠道炎症反应，对新生大鼠的NEC具有良好的治疗作用，提示MyD 88 可能是治疗NEC的潜在有效靶点[14]。在NEC发生发展过程中，TLR4也可以通过TRIF依赖性信号通路激活NF-κB，诱导肠道炎症和细胞凋亡[15]。

此外，MyD 88 非依赖信号通路和TRIF 信号通路之间可能存在相互作用。与野生型NEC 小鼠相比，MyD 88基因敲除的NEC 小鼠中TRIF 通路上的主要传导基因TRIF及IRF-3mRNA 的表达上调，提示 MyD88依赖性信号通路可能会影响TRIF通路的激活[12]。还有研究显示，MyD 88通过下调TLR 3/TRIF诱导的角膜炎症发挥负调节作用，提示MyD 88 依赖性信号通路对TIRF依赖性信号通路具有一定的抑制作用[16]。在NEC 发生过程中MyD 88基因敲除小鼠，TRIF依赖性信号通路可能代偿性激活，但其具体机制有待于进一步探索研究。

2.2 对凋亡相关蛋白的调控

在NEC发病机制中，caspase家族及Bcl-2家族蛋白参与TLR4对肠道细胞凋亡的调控。Caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，cysteinyl aspartate specific proteinase）是一组促使细胞凋亡的蛋白酶，在细胞凋亡机制网络中处于核心地位，caspase3是细胞凋亡执行过程中的关键分子，可被casepase8、casepase9等活化，分别激活死亡受体依赖性的外源 性细胞凋亡途径和由线粒体调节的内源性凋亡途径[17]。在哺乳动物细胞凋亡过程中，TLR 4 信号通路可以通过caspase8或caspase9激活caspase3，从而诱导肠上皮细胞凋亡[18]。研究表明，MyD 88基因缺失型小鼠的caspase 3、cCaspase 8 和caspase 9 表达均较野生型小鼠降低，说明MyD 88 可能同时参与了caspase 8、caspase9介导的外源性和内源性凋亡途径[12]。

Bcl-2家族蛋白是参与细胞凋亡调控的另一组蛋白，其家族成员包括促凋亡蛋白（Bax、Bad、Bak和Bok 等）和抗凋亡蛋白（包括Bcl-2 自身，Bcl-xl 和Bcl-w等），促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡对于肠道细胞的生存至关重要[19]。研究发现，在TLR 4基因敲除小鼠中诱导NEC，Bax的表达保持不变，Bcl-2的表达显著增加；而在野生型小鼠中诱导NEC，Bax的表达增加，Bcl-2的表达保持稳定，提示TLR4也通过影响促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl的表达调节肠上皮细胞的凋亡[18]。

3 通过 Notch信号通路抑制杯状细胞分化

Notch信号转导通路由Notch受体、Notch配体及细胞内效应器分子三部分组成，在发育与细胞成熟的过程中调节着细胞的增殖与分化[20]。小肠上皮祖细胞的分化能力由Notch信号通路的活性决定，Notch信号通路活化可抑制杯状细胞分化。研究发现，NEC肠道组织的TLR4及Notch信号通路相关蛋白表达量增加，杯状细胞及其分泌的黏蛋白2显著降低；在TLR4敲除NEC小鼠中，Notch信号通路相关蛋白表达受抑制，杯状细胞增加，NEC严重性降低[21]。这提示在NEC发病过程中，TLR4可能通过激活Notch信号通路抑制杯状细胞分化。进一步研究发现，TRIF缺陷小鼠回肠中杯状细胞数量显著增加，且Notch信号的激活减少，提示肠上皮细胞中的TLR4可能通过TRIF通路激活Notch信号通路，抑制肠上皮细胞分化为杯状细胞，导致肠道黏蛋白2分泌减少，肠道防御屏障损伤，从而导致NEC的发生[21]。

4 过度激活导致肠黏膜内淋巴细胞失衡

肠黏膜组织中T淋巴细胞的募集是由淋巴细胞表面表达的趋化因子受体9（C-C motif chemokine receptor 9，CCR 9）和肠上皮细胞分泌的同源趋化因子配体25（C-C motif chemokine ligand 25，CCL25）控制。TLR4激活可诱导肠上皮细胞CCL25表达，引起淋巴细胞浸润，这与NEC肠道炎症的发生密切相关[22]。促炎性辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）和抗炎性调节性T细胞（regulatory cells，Tregs）之间的平衡失调在新生儿肠道损伤中起着关键作用，在小鼠和人NEC的发病过程中，CD4+Th17淋巴细胞浸润尤为显著，这是导致NEC发生发展的重要因素。

研究发现，与足月儿相比，在早产儿肠道中，促进T 细胞向Th 17 分化的关键因子，如IL-22、IL-6 及磷酸化信号转导与转录激活因子3（phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3，pSTAT3）的表达增加。与此相一致，NEC 小鼠IL-22、IL-6、pSTAT3的表达也明显升高，并且呈现TLR4依赖性，因为在肠上皮细胞条件性敲除TLR4基因的小鼠中诱导NEC，上述因子的表达升高被阻断[5]。此外，在诱导小鼠NEC 之前给予STAT 3 抑制剂，NEC 的严重程度显著降低，提示肠上皮细胞表达的TLR4可能通过促进IL-22、IL-6及pSTAT3等促炎因子的生成，引起肠黏膜固有层中Th17细胞分化，Th17细胞进一步分泌IL-17损害肠上皮紧密连接、参与NEC的肠道炎症[5]。

此外，NEC 患儿肠黏膜固有层中单核细胞表面TLR 4 表达升高，TLR 4 可通过Myd 88 信号通路促进单核/巨噬细胞的激活，释放IL-1、IL-6、IL-12 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）等多种促炎因子，同样促进固有层中Th 17 细胞分化，导致Th17/ Treg失衡，诱导NEC的肠道炎症发生[23]。因此，由于TLR4的高表达使得NEC患者肠道微环境促炎性Th17淋巴细胞分化募集，从而促进NEC的发生发展。

5 信号转导抑制剂

5.1 TLR9

TLR9是一种细菌DNA受体，研究表明，TLR4和TLR 9 在NEC 患儿和动物模型中的表达呈现相反的趋势，在NEC 患儿的肠上皮细胞中，TLR 4 表达增加而TLR9表达减少[24]。另有研究显示，益生菌可以通过激活TLR9和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization-2，NOD2），从而抑制TLR4信号转导阻止NEC发展[10]。提示TLR9与配体结合后可能影响TLR4信号通路，抑制NF-κB的激活，从而减少肠道细胞的凋亡和细菌移位、减轻NEC的肠道损伤。

5.2 胰岛素样生长因子-1

胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor，IGF-1）是存在于母乳中的具有促生长作用的多肽类物质。研究表明，IGF-1 可改善新生NEC 大鼠模型的临床症状，降低发生率，其可能机制是IGF-1 下调TLR 4 表达，抑制炎症逆质的产生，上调MUC 2和sIgA 的表达，从而保护肠黏膜的机械和免疫屏障功能[25]。提示在早产儿配方奶粉中添加生理浓度的IGF-1可以预防或延缓NEC的发生，为NEC的防治提供了新思路。

5.3 IL-1相关受体和Toll作用蛋白

I L-1 相关受体（single Ig IL-1-related receptor,SIGIRR）和Toll作用蛋白（Toll interacting protein,Tollip）是TLR4信号通路中两个重要的负调控因子，可以通过抑制IL-1受体相关激酶（IL-1 receptor associated kinase，IRAK）磷酸化而减少TLR 4 信号下传，减轻炎症反应[26-27]。研究表明，大鼠不成熟肠道组织中TLR4表达上调，而TLR4信号负性调节因子SIGIRR和Tollip 表达下调，提示不成熟肠道组织容易出现炎症性坏死，不仅与TLR4过度表达有关，还与SIGIRR和Tollip的下调密切相关[28]，但TLR 4 负调控因子在NEC 的炎症抑制效果及具体作用机制还需要进一步探索研究。

6 结语

早产儿肠道中高表达的TLR4会通过介导肠道细胞凋亡、抑制杯状细胞分化及诱导肠道Treg/Th 17 细胞失衡等途径造成肠黏膜屏障损伤，从而导致NEC的发生。通过抑制TLR4信号通路及其下游靶点可降低NEC的严重程度，并有望成为治疗或阻止NEC发展的潜在治疗方法。