多囊卵巢综合征相关雄性激素的液相色谱-串联质谱检测

曹 正，刘 颖，丛宇婷，卢一凡，董 莹，刘京瑞，唐国栋,3，翟燕红*

(1.首都医科大学 附属北京妇产医院 检验科,北京 100020；2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司,上海 200050；3.北京市海淀区妇幼保健院 产前诊断中心,北京 100080)

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见的妇科内分泌疾病，起病多见于青春期，临床上多以月经不调为主要症状，可有不孕[1]、多毛痤疮、肥胖、黑棘皮症等多种不同临床表现[2]。一直以来，PCOS病因未明且缺乏统一的诊断标准[3]，给临床工作造成诸多不便。美国生殖医学学会与欧洲人类生殖和胚胎学会于2003年修订PCOS诊断标准[4]：① 稀发排卵或无排卵；② 高雄性激素的临床或生化表现；③ 经超声提示单侧或双侧卵巢多囊性改变。凡符合上述三条标准中的两条，并排除其他疾病导致的类似临床表现即可诊断为PCOS。

高雄性激素血症被普遍认为是PCOS关键的病理生理改变[5]，对雄性激素的检测是临床诊断PCOS的重要指标[6]。在女性体内存在多种雄性激素，其中，睾酮(T)的血清水平高于其他雄性激素，是PCOS中主要的病源性雄性激素[7]。目前，临床大多依靠检测睾酮血清水平判断患者是否存在高雄性激素血症[5]。对睾酮的检测主要有总睾酮(TT)和游离睾酮(FT)，其中在人体中发挥有效生物活性的是FT[8]。美国近期的最佳实践总结中认为FT是诊断女性雄性激素过剩最敏感的指标[7-9]。临床对FT的直接测定具有较多限制且结果的灵敏度和准确性较低。但可通过检测TT进而计算FT含量[10]。此外，硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、雄烯二酮(A4)、17-羟基孕酮(17-OHP)、双氢睾酮(DHT)也是人体内重要的雄性激素类型，一些研究表明，这些激素的血清水平在PCOS患者与正常人群中存在差别[7]，可为PCOS的诊断提供参考。50%的PCOS病人会出现血清DHEAS水平的升高，其中5%的患者有且只有DHEAS这一种雄性激素特异性升高”[11]，同时检测T和DHEAS可以提高PCOS的诊断率。A4是T的直接前体，因此往往在评估高雄性激素血症时会检测A4，据报道，雄性激素检测中如果加入A4，大约可以提高9%的PCOS检出率[9]；DHT是睾酮经过5α-Reductase作用转化而来，其雄性激素活力最强，因此在睾酮水平正常的PCOS病人中，检测DHT能够帮助解释局部目标组织中雄性激素活性过高的现象[9]；17-OHP是类固醇合成通路中的中间物质，同时也是盐皮质激素和雄性激素的前体[9]，其血清水平在非典型肾上腺皮质增生(Non-classic CAH)病人中异常升高，因此17-OHP被许多相关专业学会推荐用于PCOS病患诊断，以排除 Non-classic CAH[7,9]。

临床实验室多采用自动化免疫法检测雄性激素，但其特异性差，易受温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性、异噬性抗体等因素干扰而造成假阳性或假阴性结果，特异性和准确性有待提高[12-13]。近年来液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)开始应用于雄性激素的检测，其因所需样本量少，可同时检测多种物质，且精密度和准确性高，被认为是雄性激素检测的“金标准”[14]。有指南建议，在PCOS诊断中，将LC-MS/MS应用于临床高雄性激素血症的检测，此前有将T和DHT、T和A4进行联合检测的报道，其研究结果表明联合检测能达到较好的特异性和精确性[15-16]，但目前对上述5种雄性激素进行联合检测的报道较少。本研究建立了液相色谱-串联质谱法联合检测DHEAS、A4、T、17-OHP、DHT 5种雄性激素的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB SECIX TRIPLE QUADTM5500 三重四级杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件(美国 Applied Biosystem 公司)；岛津高效液相色谱系统(日本)。96孔蛋白沉淀板(Agela Cleanert Protein Precipitation Plate，CAT#96CD2025-Q),96孔PEP板(Agela Cleanert PEP 96 Well Microplates，CAT#PE00501-MW)。

甲醇、乙腈(Optima@LC/MS，4 L，美国Fisher Scientific公司)；标准品：T、A4、DHEAS、DHT、17-OHP均为1.0 mg/mL，1 mL/支；睾酮内标(T-C3)、雄烯二酮内标(A4-C3)、硫酸脱氢表雄酮内标(DHEAS-D5)、双氢睾酮内标(DHT-C3)、17-羟基孕酮内标(17-OHP-C3)均为100 μg/mL，1 mL/支；上述标准品和内标均购自美国Cerilliant公司。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Agela Venusil MP C18(3.0 mm×50 mm，3 μm)，流动相A：蒸馏水(含0.02%甲酸),流动相B：甲醇(含0.1%甲酸)，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～0.5 min，55% B；0.5～3.5 min，55%～90% B；3.5～4.5 min，90% B；4.5～4.6 min，90%～55% B；4.6～6.0 min，55% B，流速0.6 mL/min，柱温40 ℃，进样量10 μL。

1.2.2 质谱条件离子源为电喷雾离子源(ESI)，检测方式为正-负离子多反应监测模式(MRM)。电喷雾电压(IS)为5 500 V；雾化温度(TEM)为550 ℃；碰撞气(CAD)为8 L/min；气帘气(CUR)为35 L/min。雾化气(GS1)为80 L/min；辅助加热气(GS2)为70 L/min。5种雄性激素的质谱参数见表1，选取Q1质量数为母离子，Q3质量数为子离子进行定量分析。

表1 5种雄性激素的质谱参数

*DP：declustering potential；CE：collision energy；CXP：collision cell exit potential

1.3 标准溶液的配制

取适量标准品，用甲醇定容后，用甲醇稀释成不同质量浓度的系列混合标准溶液。稀释后A4的质量浓度0.10、0.20、0.40、1.20、6.00、12.00 ng/mL，T、DHT和17-OHP为0.05、0.10、0.20、0.60、3.00、6.00 ng/mL，DHEAS为10.00、20.00、40.00、120.00、600.00和1 200.00 g/mL，上述即为标准曲线C1～C6标准溶液，将标准溶液置于-20℃保存，使用前取出在室温下放置0.5 h，混匀后，即可进样分析。DHEAS、A4、T、17-OHP和DHT的内标用甲醇乙腈(1∶1)分别稀释至5.00、2.00、10.00、2.00、20.00 ng/mL。

1.4 样本前处理

取50 μL血清样品，加入10 μL内标溶液和150 μL甲醇，振摇2 min，过蛋白沉淀板，加入150 μL水，振摇1 min。200 μL甲醇和200 μL水活化PEP板，加载样品，分别经200 μL的 20%乙腈、正己烷淋洗后，用50 μL甲醇洗脱，在洗脱液中加入50 μL水涡旋混匀，取10 μL上机检测。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 前处理方法的优化因雄性激素在体内的含量均较少，因此对样本的前处理关系到实验结果的准确性。实验对比了蛋白沉淀法和固相萃取法，其中前者快速、简便，但处理的样品净化程度低，对于体内含量较少的雄性激素并不是最优方法。本实验采用蛋白沉淀+固相萃取的方法对样本进行前处理，将已经进行蛋白沉淀的样品通过萃取柱，可有效去除样品基质中的干扰物，浓缩目标分析物，提高检测灵敏度，减少基质效应，适用于对雄性激素的检测。

2.1.2 色谱-质谱条件的优化考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合物分别与水、0.1%甲酸、0.02%甲酸组成的不同流动相对5种雄性激素的分离效果及色谱图峰形的影响。在对比了不同流动相以及加入甲酸前后的分离结果后，最终选择甲醇与水为流动相体系，并分别加入0.1%甲酸和0.02%甲酸，以使目标分析物的响应强度得到明显提高，且所得峰形良好。进一步考察了不同柱温下(35、40、45 ℃)5种雄性激素的响应强度及分离情况，结果表明在柱温40 ℃下，可得到较理想的实验结果。

采用ESI正-负离子电离模式扫描分析，在一级质谱分析确定母离子后，进行二级质谱的子离子分析扫描，对去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)以及碰撞室出口电压(CXP)进行优化，优化后的质谱条件见表1。此时各雄性激素的检测信号高，峰形良好。

图1 5种雄性激素的色谱图

在优化条件下，5种雄性激素的色谱图见图1。从图中可观察到各雄性激素的色谱图清晰，峰形良好，在相关保留时间附近无干扰峰，DHEAS、A4、T、17-OHP和DHT的保留时间分别为2.47、3.15、3.49、3.63、4.08 min，表明各雄性激素可在5 min内完成分离检测。

2.2 线性关系、定量下限及相对标准偏差

将标准溶液按照正常样本进行处理后进样分析，考察各雄性激素的线性关系。以样品中待测物的质量浓度为横坐标(X,ng/mL)，待测物和内标物的峰面积比值作为纵坐标(Y)，用加权(1/X2)最小二乘法进行回归计算，得到回归方程。结果显示(见表2)，5种雄性激素在一定质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.995。以信噪比(S/N)=10，相对标准偏差(RSD)小于20%作为各成分的定量下限(LOQ)，计算得到5种雄性激素的LOQ为0.025～5.00 ng/mL，RSD均小于20%，满足统计学要求。

表2 5种雄性激素的线性范围、相关系数、定量下限及相对标准偏差

表3 5种雄性激素的批内相对标准偏差、批间相对标准偏差及回收率

2.3 相对标准偏差与加标回收率

以5个患者血清混合作为本底，取40 μL混合人血清与一定量的雄性激素标准溶液混合，制成低、高浓度的质控血清(具体浓度见表3)。在1天内分别对低、高2个浓度水平的质控血清进行10次重复处理，检测5种雄性激素含量，计算批内相对标准偏差(Intra-RSD)；对低、高2个浓度水平的质控血清测定5次，连续测定5 d(n=25)，检测5种雄性激素含量，计算批间RSD(Inter-RSD)，观察精密度，同时计算加标回收率。结果显示，5种雄性激素的批内RSD为3.7%～8.7%，批间RSD为4.1%～8.2%，加标回收率为96.0%～105%，表明本方法对不同质量浓度标本检测均具有较好的精密度和准确度。

2.4 样本的稳定性

取未处理血清样本，在4 ℃下保存3 d，分别于第0、1、3 d按本方法检测雄性激素的含量；将第0 d处理后的样本于15 ℃下放置3天，分别于第0、1、3 d检测雄性激素含量，将检测值与第0 d的结果作比较，观察样本稳定性。检测结果显示(见表4)，按本方法处理后的雄性激素样本，在4 ℃与15 ℃下的稳定性均在80%～120%范围内，说明本方法的稳定性良好。

表4 5种雄性激素的稳定性

2.5 临床样本的检测

3组不同临床血清样本(PCOS病人-血清型高雄性激素、PCOS病人-临床型高雄性激素、非PCOS-正常女性)各20例，采用上述方法进行样本前处理，并对血清中DHEAS、A4、T、17-OHP 、DHT进行联合检测，以观察此方法在临床中的实际应用价值。结果显示，对PCOS病人中血清型高雄性激素及临床型高雄性激素患者的检出率均大于90%，与单纯检测一种雄性激素相比，检测的精确度与准确性大大提升，在一定程度上解决了女性体内雄性激素水平低、检测难的问题(见表5)。研究结果表明，利用本方法进行上述5种雄性激素的联合检测，对临床诊断高雄性激素血症及PCOS病人具有较高的应用价值。

(续表5)

GroupDHEASA4T17-OHPDHT1474.170.460.660.240.231692.610.801.150.420.38∗1613.250.900.601.240.72∗1357.511.241.014.27∗0.37∗1622.810.820.692.98∗0.94∗1326.180.930.953.45∗0.16702.870.960.532.07∗0.211758.830.912.041.970.262966.60∗1.061.100.450.251461.491.060.541.940.081132.420.590.834.31∗0.11876.940.980.802.73∗0.171151.221.150.793.04∗0.23

reference interval:DHEAS:280.00～2 500.00 ng/mL,A4:0.30～2.00 ng/mL,T:0.08～6.00 ng/mL,17-OHP:<2.00 ng/mL,DHT:<0.3 ng/mL

3 结 论

本研究建立了LC-MS/MS联合检测血清中DHEAS、A4、T、17-OHP、DHT的分析方法，讨论了LC-MS/MS法在临床中高雄性激素血症诊断中的应用价值，从而为PCOS的诊疗提供依据。实验结果表明，本方法快速简便，具有较高的精确性和准确性，可保证在血清浓度较低的条件下获得较为理想的检测结果，满足临床大量检测的需求，对临床高雄性激素血症和PCOS的诊断具有重要意义。