黄芩-栀子配伍治疗糖尿病肾病大鼠的尿液代谢组学研究

程晓旭,门丽慧,皮子凤,宋凤瑞,刘志强

(1.中国科学院长春应用化学研究所 长春质谱中心 吉林省中药化学与质谱重点实验室，吉林 长春 130022；2.中国科学技术大学 应用化学与工程学院，安徽 合肥 230026；3.吉林大学 基础医学院，吉林 长春 130021)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是指糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，又称糖尿病肾小球硬化症[1-2]，是糖尿病的常见并发症之一，极易发展为终末期肾病[3]。根据流行病学统计研究，预计到2030年，世界范围内的糖尿病患者将达到3.66亿，而糖尿病肾病患者将超过1亿。糖尿病肾病发病机制复杂，涉及因素众多。许多研究表明，中药可以通过多途径、多靶点治疗糖尿病并发症，其中，中药黄芩和栀子对糖尿病肾病的治疗作用日渐受到关注。

黄芩(RadixScutellariae)为唇形科植物黄芩(ScutellariabailensisGeorgi)的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等作用[4]。黄酮类化合物为黄芩的主要活性成分，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素是黄芩的特征性成分。研究表明黄芩及其黄酮类活性成分具有降糖、抗氧化、调节细胞因子和调节糖尿病肾病引起的血流动力学改变等作用，可以多途径、多靶点延缓糖尿病肾病的发展过程[5-6]。

栀子(Gardeniajasminoides)是茜草科栀子属植物，中药栀子是其干燥成熟果实，具有凉血解毒、清热利尿的功效[7]。研究发现，栀子的主要成分为环烯醚萜类化合物，包括栀子苷、山栀苷、京尼平苷等[8]。大量体内外实验表明栀子具有抗炎、抗氧化、降血压等生物活性，对糖尿病及其并发症的治疗效果显著[9]。

据历代本草及医学文献记载，黄芩-栀子药对为古方常用药对，配伍应用于许多传统经方。刘舟[10]收集了《中华医方精选辞典》和《中药大辞典》中有关黄芩的论述和方剂,共收集到含黄芩的成方1 067个，涉及中药272味，除黄连外，栀子与黄芩的配伍频次位居第二，在228首方剂配伍中出现,被广泛应用于治疗肺系病、肾系病、心系病、肝胆系疾病和脾胃系疾病。《中国药典》[11](2015年版一部)收载了52首含黄芩栀子配伍的方剂，如栀芩清热合剂、八正合剂、分清五淋丸、龙胆泄肝汤、导赤丸、黄连解毒汤等。黄芩、栀子饮片配伍有其深厚的中医药理论基础，是中医临床相须炮制配伍的典型范例。

糖尿病肾病早期并没有明显的临床症状，但是许多内源性代谢物在临床症状出现以前已经发生了改变。代谢组学可以对内源性代谢物进行全面分析，被广泛应用于疾病发生机制的研究[12]。Solini等[13]利用超高效液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法对286例Ⅱ型糖尿病患者的血清样本和尿液样本进行了分析，鉴定出5种能够早期预测肾功能损伤进展情况的代谢物。Hirayama等[14]利用毛细管电泳-质谱联用的方法对78例糖尿病患者的血清样品进行了分析，鉴定出用来区分糖尿病肾病不同进展阶段的19个代谢物。将代谢组学技术应用于糖尿病及其并发症的研究中，对糖尿病肾病的早期诊断和早期治疗具有重要意义。因此，本文采用代谢组学方法，基于UHPLC-Q-TOF MS技术，对黄芩-栀子药对对糖尿病肾病大鼠治疗前后尿液中的内源性代谢物进行全面地分析鉴定，将药对治疗组与前期工作中黄芩治疗组(HQ group)和栀子治疗组(ZZ group)的治疗效果进行了比较，从整体角度阐述该药对的配伍科学性及其作用机制。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Waters ACQUITY UHPLC system，配有BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm×50 m)；Waters Q-TOF SYNAPT G2 HDMS质谱仪，配有4.1版本的MarkerLynx数据处理系统和EZinfo 2.0统计软件。

1.2 试 剂

中药黄芩、栀子(北京同仁堂长春药店，由长春中医药大学王淑敏教授鉴定)；链脲佐菌素(STZ)购自Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲酸(色谱纯)购自Fisher Scientific公司；去离子水经Milli-Q plus制得；血糖仪、血糖试纸购自北京怡成生物电子技术有限公司。

SD 大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证行SCXK(辽)2015-0001。

2 方法与结果

2.1 动物实验

正常对照组(Control group，C组)：8只SD雄性大鼠，标准饲料正常喂养。

Ⅱ型糖尿病大鼠造模参照文献[15]进行，利用高脂高糖饲料喂养并腹腔注射链脲佐菌素(STZ)成功建立糖尿糖大鼠模型。16只糖尿病大鼠随机分为模型组(Model group，M组)和黄芩-栀子药对组(HZYD group)，组间血糖差异≤1 mmol/L。

将黄岑-栀子提取物粉末使用超纯水溶解，黄岑-栀子药对组按3 g生药/kg的剂量每日灌胃给药1次，模型组和正常对照组分别灌胃与黄岑-栀子药对组同等体积的蒸馏水，连续灌胃12周。

2.2 样品收集与制备

按2∶1的质量比准确称取中药黄芩和栀子药材粗粉，以8倍量60%乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液并旋蒸至近干后冻干，得到黄芩-栀子提取物粉末，使用时按给药量溶解。

收集给药12周后的大鼠尿液，记录大鼠24 h排尿量，样品分装，-80 ℃冰箱保存待测。使用前4 ℃融化尿液样品，取1 mL于1.5 mL离心管中，在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 μm水相滤膜过滤，供UHPLC-Q-TOF MS测定。

2.3 色谱-质谱条件及样品分析

2.3.1 色谱条件流动相A：0.1%甲酸水,流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～3 min,5%～20% B；3～6 min,20%～40% B；6～8 min,40%～100% B；8～10 min,100% B；10～10.1 min,100%～5% B；10.1～14 min,5% B；流速：0.4 mL/min，柱温35 ℃，样品室温度4 ℃，进样量5.0 μL。

2.3.2 质谱条件电喷雾离子源正负离子检测模式，电离源温度为120 ℃，去溶剂气温度为350 ℃，锥孔气和去溶剂气均为氮气，流速分别为50 L/h和700 L/h。正离子模式下毛细管电压为3.0 kV，锥孔电压为30 V，提取锥孔电压为5.0 V；负离子模式下毛细管电压为2.5 kV，锥孔电压为30 V，提取锥孔电压为5.0 V。扫描范围为100～1 000m/z，扫描时间为0.2 s。以甲酸钠建立质量轴标准曲线，亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin，LE)进行实时质量校正以确保质量精度和重现性。

为得到相对全面和整体的代谢物轮廓，保证分析系统的可靠性及稳定性，在整个分析过程中，重复运行质控样品(Quality control，QC)来衡量UPLC-MS分析方法的稳定性。从正常样品中各取30 μL混合，制得QC样品，在用于方法验证时，为避免误差，QC样品将被随机测试。样品分析前，先运行6次QC样品以平衡系统，样品检测过程中，每检测10个正常样品后运行1次 QC 样品以衡量系统的稳定性。

2.4 数据分析

采用MassLynx V 4.1(Waters)软件对MassLynx V4.1 UHPLC-MS的原始数据进行峰检测，MarkerLynx Application Manager(Waters)将自动进行离子对提取、峰对齐、峰匹配和峰强度校正,得到的数据矩阵通过Umetrics Ezinfo 2.0(Waters Corporation，Milford，USA)进行多变量分析。利用生物学数据库，如HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、Massbank(http://www.massbank.jp/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)等进行生物标记物的鉴定和代谢通路的分析。

2.5 生物标记物的鉴定

采用基于UHPLC-Q-TOP MS的代谢组学方法分析C组大鼠和M组大鼠尿液中内源性代谢物的变化，结合主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)进行数据分析，筛选潜在生物标记物。由PCA得分图(图1)可知，正离子和负离子模式下M组与C组大鼠的尿液代谢轮廓区分明显，DN大鼠尿液代谢出现明显的扰动。S-plot图(图2)中每一个点都代表一个化合物，距离原点越远的点，其代表的化合物对分组的影响越大，VIP值越高。选择VIP值大于1且独立T检验的p值小于0.05 的化合物为潜在生物标记物,根据它们的精确分子量和串联质谱结果与 Human Metabolome Database(HMDB)和 Mass Bank等质谱数据库质谱信息的匹配，对可能的潜在标记物进行鉴定。综合以上信息，共鉴定出与糖尿病肾病相关的潜在生物标记物31个，对比黄岑-栀子药对组与模型组中各标记物的含量，得到药对回调的生物标记物16个，结果列于表1及表2。

图2 M组和C组大鼠12周尿液样品经OPLS-DA分析获得的S-plot图

表1 正离子模式下DN大鼠尿液生物标记物和变化趋势

(续表1)

PotentialbiomarkersRt(min)Measuredmass(Da)Error(ppm)MolecularChangetrendM/CHZYD/MHQ/M[16]ZZ/M[17]3-Indolecarboxylicacidglucuronide(3-吲哚羧酸葡糖苷酸)1.89338.08681.0C15H15NO8↑×↓×Glucose(葡萄糖)1.21181.06918.6C6H12O6↑×↓×4,6-Dihydroxyquinoline(4,6-二羟基喹啉)3.62162.05659.5C9H7NO2↓×↑×Histidinal(组氨醛)0.68140.08068.8C6H9N3O↑×↓×Imidazoleaceticacid(咪唑乙酸)0.61127.04937.1C5H6N2O2↑×↓×Phenylaceticacid(苯乙酸)2.60137.05813.6C8H8O2↑×↓×Ornithine(鸟氨酸)4.81133.09967.9C5H12N2O2↑×↓×Leucine(亮氨酸)2.30132.10097.6C6H13NO2↑×↓×Pantetheine(泛酰硫氢乙胺)2.47279.13812.9C11H22N2O4S↑×↓×Xanthosine(黄嘌呤核苷)3.12285.08102.7C10H12N4O6↑×↓×5-Hydroxykynurenamine(5-羟基犬尿胺二盐酸盐)2.97181.09596.9C9H12N2O2↓×-×Phenylacetaldehyde(苯乙醛)3.00121.06689.2C8H8O↑×-×Hydrocinnamicacid(氢化肉桂酸)7.57151.07533.6C9H10O2↑--×L-Cysteine(L-半胱氨酸)3.20122.02808.0C3H7NO2S↓×-×Kynurenicacid(犬尿喹啉酸)2.17190.05000.7C10H7NO3↑××↓Creatinine(肌酐)0.86114.06652.7C4H7N3O↑××↓6-Hydroxy-5-methoxyindoleglucuronide(6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸)2.38340.10377.1C15H17NO8↑××-6-Methoxy-pyridine-3-carboxylicacid(6-甲氧基-吡啶-3-羧酸)0.61154.05075.4C7H7NO3↓××↑3-Methoxybenzenepropanoicacid(3-甲氧基苯丙酸)3.52181.08674.3C10H12O3↓××↑Indole-5,6-quinone(吲哚-5,6-苯醌)2.27148.04006.7C8H5NO2↓××↑Thymine(胸腺嘧啶)1.02127.05063.1C5H6N2O2↓××-Homocysteinethiolactone(同型半胱氨酸硫代内酯)5.46118.03318.4C4H7NOS↓××↑

M/C：metabolite change trend in M group compared with C group;HZYD/M：metabolite change trend in HZYD group compared with M group;HQ/M：metabolite change trend in HQ group compared with M group;ZZ/M：metabolite change trend in ZZ group compared with M group;the up “↑” and down “↓”arrows represent the relative increasing or decreasing trend of the metabolites,“-”represents no significant differences between the two groups,“×”denotes the metabolite were not identified as potential biomarkers(M/C：模型组vs空白组；HZYD/M：黄芩-栀子药对组vs模型组；HQ/M:黄芩组vs模型组；ZZ/M：栀子组vs模型组；“↑”表示含量上升，“↓”表示含量下降，“-”表示两组相比较时，该化合物含量没有显著性差异；“×”表示该化合物未被鉴定为潜在生物标记物)

表2 负离子模式下DN大鼠尿液生物标记物和变化趋势

(续表2)

PotentialbiomarkersRt(min)Measuredmass(Da)Error(ppm)MolecularChangetrend∗M/CHZYD/MHQ/M[16]ZZ/M[17]Phenylacetylglutamine(苯乙酰谷氨酰胺)3.54263.10264.3C13H16N2O4↑×↓×Phenylpyruvicacid(苯丙酮酸)1.82163.04215.7C9H8O3↑×↓×3,4-Dihydroxymandelaldehyde(3,4-二羟基甘露醛)1.20167.03743.7C8H8O4↑×↓×Cholicacid(胆酸)9.01407.27991.7C24H40O5↑××↓3-Oxooctanoicacid(3-酮基辛酸)4.69157.08672.0C8H14O3↓××↑

*the same as those in table 1

2.6 生物标记物代谢通路分析

为阐明这些潜在生物标记物与糖尿病肾病的关系以及潜在生物标记物之间的相互联系，在KEGG中检索已获得的潜在生物标记物，将得到的信息联系起来，建立了黄芩-栀子药对治疗糖尿病肾病代谢网络图，结果见图3。

图3 黄芩-栀子药对治疗糖尿病肾病代谢网络图

由代谢网络图可知，黄芩-栀子药对可能会通过调节糖尿病肾病引起的胆汁酸合成、能量代谢、苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢等代谢通路的异常来阻断病情的发展，发挥治疗作用。

2.6.1 胆汁酸的生物合成通路胆汁酸是哺乳动物胆汁中发现的类固醇酸，是衍生自胆固醇分解代谢的两亲性甾体分子。脱氧胆酸是胆汁酸合成通路的重要组成部分，12-酮基去氧胆酸、3-氧代-4,6-胆甾烯酸和7-酮基脱氧胆酸是胆汁酸类内源性代谢物。作为一种重要的内分泌信号因子，胆汁酸可以对脂质、葡萄糖和能量代谢稳态产生不同影响，与肥胖和糖尿病的发病相关[18]。研究表明，正常体重以及超重Ⅱ型糖尿病患者的血糖与尿液胆汁酸排泄量呈正相关，机体通过胆汁酸信号传导的代偿性增加来维持体内葡萄糖平衡[19]。本研究中糖尿病肾病大鼠尿液中胆汁酸的含量急剧上升，与上述研究结果一致。黄芩-栀子药对可以降低胆汁酸合成通路中脱氧胆酸的含量(表1)，调节上升的胆汁酸，显著降低12-酮基去氧胆酸、3-氧代-4,6-胆甾烯酸、脱氧胆酸和7-酮基脱氧胆酸的含量，提示黄芩-栀子药对可能通过减少胆汁酸的合成和调节胆汁酸代谢改善糖尿病肾病病程发展。本课题组前期分别考察了栀子、黄芩单味药对糖尿病肾病大鼠尿液中内源性代谢物的影响[16-17]，综合表1和表2结果可知，黄芩对胆汁酸的合成与代谢并无影响，黄芩-栀子药对对胆汁酸的调节作用可能主要来自于栀子。

2.6.2 能量代谢通路三羧酸循环是机体的主要供能途径，琥珀酸和柠檬酸是其重要组成部分，二者的含量变化反应了供能状况的变化。三羧酸循环代谢向氧化磷酸戊糖途径的通量相对增加，会导致琥珀酸产生增加，减少通路中副产物的形成，破坏氧化还原平衡[20-21]。琥珀酸和柠檬酸不仅与能量代谢相关，还是肾脏损伤的标记物。本研究中，模型组大鼠尿液中琥珀酸含量升高，柠檬酸含量降低，可能是三羧酸循环和肾脏功能损伤共同作用的结果。栀子有加重柠檬酸含量下降的作用，黄芩有回调柠檬酸含量的作用，配伍之后，综合二者药效，黄芩-栀子药对仍起到了回调柠檬酸含量的作用。此外，由表2可以看出，黄芩和栀子单味药并未对琥珀酸含量的升高有任何调节作用，但黄芩-栀子药对却对琥珀酸起到了回调作用，这说明黄芩与栀子之间，黄芩、栀子与药对之间的作用都不尽相同，黄芩和栀子的配伍使药对发挥了单味药没有的功效。

2.6.3 苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸代谢通路慢性肾衰竭与苯丙氨酸和酪氨酸的合成、代谢以及尿液排泄量的变化密切相关[22-23]。苯丙氨酸是酪氨酸的前体化合物，肾脏功能受到损害时，苯丙氨酸向酪氨酸转化受阻，受阻程度与肾脏受损程度相关。苯丙氨酸是一种必需氨基酸，主要代谢途径为羟基化生成酪氨酸。苯丙氨酸还可以转化为苯丙酮酸，苯丙酮酸还原后生成苯基乳酸，或氧化脱羧生成苯乙酸，但这种途径作用较弱[24]。综合表1和表2可知，糖尿病大鼠尿液中苯丙酮酸、苯乳酸、苯乙酸和苯乙酰谷氨酰胺含量均升高，可能意味着苯丙氨酸向酪氨酸转化受阻，从而导致苯丙氨酸更多的向苯丙酮酸代谢途径代谢。黄芩可以下调苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸的含量，但栀子和药对均无下调作用，说明对苯丙氨酸代谢通路的调节作用主要来自于黄芩。

肾脏是消除色氨酸及其代谢物的主要器官。95%左右的色氨酸在肾脏经犬尿氨酸途径代谢，最终产生犬尿喹啉酸等代谢物[25-26]。犬尿喹啉酸与肾小球滤过率呈负相关，色氨酸代谢异常与Ⅱ型糖尿病的发病息息相关[27]。与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠尿液中犬尿喹啉酸含量升高，表明肾脏功能受到损害。栀子可以降低犬尿喹啉酸的含量，对肾脏起到一定的保护作用。黄芩和药对都未对犬尿喹啉酸起到调节作用，可能是药对配伍后，来自栀子的部分药效降低了。

2.6.4 尿毒素代谢通路除图3所示的各种代谢通路外，尿毒素代谢也是黄芩-栀子药对治疗糖尿病肾病的重要代谢通路。硫酸对甲酚是对甲苯酚通过尿液排泄的衍生物，是一种典型的尿毒素。肠道厌氧菌将食物中的苯丙氨酸和酪氨酸转变为4-羟基苯乙酸，脱羧后转变为对甲酚，对甲酚在肠道上皮细胞的作用下转变为硫酸对甲酚[28]。硫酸对甲酚是肾病中常见的蛋白结合分子，作为一种尿毒素，具有高蛋白结合率、低排泄率和促氧化应激作用，较难通过透析排出体外[29]。硫酸对甲酚的排泄量与肾小球滤过功能密切相关，糖尿病肾病导致肾脏功能受损时，体内硫酸对甲酚含量升高[30]，促使炎症发生，硫酸对甲酚在血液中与白蛋白的结合增多，可以加速肾病发展，对全身多个组织和器官造成毒性损害，是肾脏疾病恶化的重要指示代谢物。糖尿病肾病大鼠尿液中的硫酸对甲酚含量明显升高，经黄芩、栀子单味药治疗后，含量并未发生变化，但经黄芩-栀子药对治疗干预后，其含量显著降低,说明黄芩-栀子药对可能通过对肠道菌群的调节，减少硫酸对甲酚的产生，或通过增强肾小球滤过功能使硫酸对甲酚排泄量增多。可合理推测经黄芩-栀子药对治疗后，受损的肾脏功能得到了改善。

3 结 论

本研究采用 UPLC-Q-TOF MS 结合 OPLS-DA 的分析手段，进行了黄芩-栀子药对治疗糖尿病肾病大鼠的尿液代谢组学研究，对糖尿病肾病大鼠尿液中的内源性代谢物和代谢通路进行了全面地分析。黄芩-栀子药对可以回调16种糖尿病肾病相关的生物标记物，主要通过调节胆汁酸的合成与代谢、能量代谢和尿毒素代谢改善糖尿病肾病引起的尿液代谢轮廓变化。从黄芩-栀子药对整体作用角度初步阐明了其治疗糖尿病肾病的作用机理，证明了黄芩-栀子药对配伍后，可以产生单味药没有的药效。