超高效液相色谱-质谱法同时测定舒血宁注射剂中20种黄酮醇苷与萜类内酯成分

金高娃，宋春颖，闫竞宇，刘艳芳，沈爱金，郭志谋*，梁鑫淼

(1.中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，辽宁 大连 116023；2. 中国科学院大连化学物理研究所-中国医药城生物医药创新研究院，江苏 泰州 225300)

舒血宁注射剂为银杏叶提取物制成的灭菌水溶液，主要用于治疗缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、脑栓塞、脑血管痉挛等[1-2]，其中起作用的成分为黄酮和萜类内酯，每类物质均包括多种化合物，如黄酮类包括芦丁、槲皮苷、异槲皮苷、杨梅苷、山奈苷、异鼠李苷等；萜类内酯包括银杏内酯A、B、C、白果内酯等。目前其质量控制主要采用液相色谱法，如中国药典2015版[3]采用紫外检测法对银杏提取物中的黄酮类进行检测。但由于对照品的缺乏，通常将黄酮苷类物质酸解为黄酮苷元后再进行总黄酮醇苷的换算。而对于内酯类化合物，由于其无紫外吸收，多采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测。已有检测方法中，大都将黄酮和萜类内酯分开测定，时间较长，溶剂消耗也较大；采用ELSD检测时灵敏度低、重复性差；由于标准品缺乏，中国药典2015版规定银杏提取物中总黄酮醇苷不得少于24.0%，萜类内酯不得少于6.0%；卫生部药品标准中药成方制剂中规定舒血宁注射剂5 mL规格含总黄酮醇甙4.2 mg，均规定的总量，但这并不能全面代表注射剂的性质，不同注射剂即使黄酮总量相近，但各单个黄酮苷的含量可能差异较大。为避免添加某种黄酮苷元使产品质量符合国家标准，发展舒血宁注射剂中多种有效成分同时测定的方法具有重要意义。

为解决黄酮和萜类内酯化合物同时检测的问题，发展通用检测器如蒸发光散射(ELSD)[4]、电喷雾(CAD)[5]、质谱(MS)[6]等方法是较可行的途径。对于多种物质的同时定量，采用ELSD及CAD等检测器时，需达到基线分离才能准确定量。而采用质谱检测时，对于保留时间相同的化合物，只要定量离子对不同，即可进行准确定量。目前已有采用液相色谱-质谱联用技术测定银杏提取物中化合物的文献报道，如张兰桐等[7]采用HPLC-MS法同时测定了舒血宁注射液中的4种萜类内酯和3种黄酮苷元;丁宏等[8]采用UPLC-Q/Orbitrap-HRMS鉴别和定量了含银杏叶提取物保健食品中的5种萜类内酯和3种黄酮醇，但样品仍需酸解后再进行测定。除黄酮苷元的定量分析外，胡蓉蓉等[9]建立了UPLC-MS/MS测定银杏叶提取物中10个黄酮类成分的分析方法；吴惠勤等[10]建立了银杏保健茶中16种黄酮类物质的LC-MS/MS方法，16种黄酮类化合物均为黄酮苷元，样品也需酸解后测定。除此之外，Bi等[11]发展了两步液液萃取的前处理方法，采用UPLC-MS/MS研究了银杏制剂中的3种黄酮苷元和4种萜类内酯在小鼠血浆中的药代动力学。孙毓庆[12]及苏薇薇[13]等的研究表明，银杏制剂中含有较多物质，并采用LC-MS方法分别鉴定了银杏叶提取物中的12个黄酮醇苷和30个黄酮类化合物。对每个黄酮苷的定量更能反映出银杏制剂的质量，Cheng等[14]采用UPLC-MS/MS定量分析了银杏叶提取物中的4个黄酮醇苷、5个黄酮苷元、5个萜类内酯及2个银杏酸；Guo等[15]采用UPLC-QTOF-MSE测定了银杏叶提取物中包括17种黄酮醇苷和5种萜类内酯在内的33个化合物，有利于更进一步的银杏叶提取物及制剂的质量研究。

因受限于黄酮醇苷类化合物对照品的缺乏，对银杏制剂中黄酮醇苷的定量研究尚不深入，本课题组前期自主制备得到了银杏叶提取物中的16种黄酮醇苷化合物和4种萜类内酯，以这些物质为对照品，建立了UPLC-MS/MS方法同时定量舒血宁注射液中20种黄酮醇苷和萜类内酯的分析方法。该方法前处理简单、快速灵敏且重复性好，适用于舒血宁注射剂的质量研究。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters UPLC Acquity UPLC I-CLASS超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配自动进样器、高压二元溶剂管理器、柱温箱和Masslynx工作站；质谱仪为Waters Xevo TQ-XS(美国Waters公司)。

甲酸(色谱级，北京百灵威科技有限公司)；乙腈和甲醇(色谱纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司)；实验用水由Milli-Q超纯水机(美国密理博有限公司)制备。

槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、杨梅素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖芸香糖苷、万寿菊素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、丁香黄素-3-O-芸香糖苷、3’,5’-二甲氧基杨梅素-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯均为自主制备，HPLC纯度>95%。舒血宁注射剂购于大连沙河口星海湾富国社区卫生服务中心。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件色谱柱:Acquity UPLC BEH Shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm);流动相:A为0.1%甲酸，B为乙腈，梯度洗脱程序:0～10 min，12%～38% A；流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为5 μL。

1.2.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)扫描模式，毛细管电压3.10 kV，脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流速1 000 L/h，进样锥气体流速150 L/h。选取Q1质量数为母离子，Q3质量数为子离子进行定量分析。

1.3 标准溶液的制备

分别精密称取16种黄酮醇苷和4种萜类内酯标准品，用50%(体积分数)甲醇水溶液配成质量浓度为2 000 μg/mL单标储备液。取各单标储备液适量于同一容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容。使用时逐级稀释配成0.005 ～40 μg/mL的系列混合标准溶液。

1.4 样品前处理

各舒血宁注射剂采用体积分数50%甲醇水溶液稀释20倍，定容、备用。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

在电喷雾离子源正、负模式下均进行了舒血宁注射剂样品的分析。结果发现，萜类内酯化合物在负模式下的响应较正模式强，而黄酮类化合物在正、负模式下均有响应，因此实验采用负离子模式进行20种化合物的质谱检测，并通过Masslynx软件自动优化各化合物多反应监测(MRM)模式下的锥孔电压(CV)和碰撞能(CE)。流动相采用乙腈-水，在水相中加入适量甲酸可改善黄酮醇苷类化合物的峰形[14-16]，通过优化流动相比例，使各化合物定量时无干扰，且保留时间相同的化合物具有不同的定量离子对，并可在10 min内完成舒血宁样品中20种待测物的分析，完全满足定量要求。优化条件下的20种黄酮和萜类内酯化合物质谱参数见表1，MRM谱图见图1。

表1 20种目标化合物的保留时间(RT)、多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压(CV)和碰撞能(CE)

(续表1)

No.CompoundRetentiontime/minMRMtransitions(m/z)CV/VCE/eV133’,5’-Dimethoxymyricetin-3-O-rutoside(3’,5’-二甲氧基杨梅素-3-O-芸香糖苷)5.88653.3>345.1∗,653.3>330.0100,10040,3014Kaempferol-3-O-2”-glucosylrhamnoside(山奈酚-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷)6.56593.2>284.1∗,593.2>255.198,9834,5615Quercetin-3-O-p-coumaricglucosylrhamnoside(槲皮素-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷)7.90755.2>300.0∗,755.2>609.3100,10044,3016Kaempferol-3-O-p-coumaricglucosylrhamnoside(山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷)8.66739.3>284.1∗,739.3>593.3100,10046,3017GinkgolideA(银杏内酯A)7.03407.2>319.2∗,407.2>335.262,6214,1418GinkgolideB(银杏内酯B)7.09423.2>367.2∗,423.2>125.028,2814,2819GinkgolideC(银杏内酯C)4.42439.2>383.2∗,439.2>125.030,3014,3420Bilobalide(白果内酯)5.07325.2>163.1∗,325.2>193.130,3020,12

*：quantitative ion pair

图1 20种化合物的UPLC-MS/MS MRM谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线、检出限及定量下限配制20种化合物质量浓度为0.005 ～ 40 μg/mL的系列混合标准工作溶液，在优化条件下测定，以各待测物的定量离子对峰面积(y)对其相应质量浓度(x,μg/mL)进行线性回归，以3倍信噪比(S/N=3)确定方法的检出限(LOD)，以S/N=10确定方法的定量下限(LOQ)。结果显示，20种待测物在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数(r2)不小于0.963 3，LOD为0.02～1.59 ng·mL-1，LOQ为0.07～5.30 ng·mL-1。20种待测物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量下限结果见表2。

表2 20种待测物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量下限

the numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2.2 回收率及相对标准偏差取舒血宁注射剂在稀释前分别加入一定量16种黄酮醇苷和4种萜类内酯标准溶液，配成低、中、高3个质量浓度的加标溶液，每个浓度平行3个，在优化条件下测定，计算方法的加标回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示,20种化合物的平均回收率为85.9%～109%，RSD不高于9.5%(表3)，表明方法的结果可靠且符合分析要求。

表3 舒血宁注射剂中20个化合物的回收率及相对标准偏差(n=3)

*recovery=(found-background)/added×100%；the numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2.3 精密度、重复性与稳定性采用质量浓度均为1.0 μg/mL的20种待测物混合对照品溶液，采用本方法在优化条件下重复进样6次，分别计算20种化合物峰面积的相对标准偏差(RSD)，并连续测定3 d。结果显示，20种待测物的日内RSD(n=6)及日间RSD(n=18)分别为0.65%～4.8%和1.5%～6.5%，表明仪器性能良好，重现性高。取6份舒血宁注射剂样品分别稀释20倍后测定，计算得20种化合物峰面积的RSD为0.62%～4.6%(该样品中不含白果内酯)，表明方法的重复性良好。样品配制后，分别在室温下放置2、4、8、18、24 h进行测定，得20种目标物峰面积的RSD为0.93%～8.6%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.3 实际样品测定

采用本方法对4个厂家(标记为A～D)的舒血宁注射剂样品进行测定，结果见表4。不同厂家的样品中各化合物的含量差异较大，A、B厂家产品中的槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量较C、D厂家稍高。C厂家产品中槲皮素-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖基鼠李糖苷、银杏内酯A、银杏内酯B、白果内酯含量较高。A厂家产品中不含白果内酯，B厂家产品中白果内酯含量极低。A和D厂家产品的总黄酮醇苷和总萜类内酯的含量相当，但各化合物的含量存在明显差异，因此有可能带来不同的疗效。由此可见，对舒血宁产品中各化合物的定量分析可为其质量控制提供新思路。

表4 不同厂家舒血宁注射剂样品中20个化合物的定量结果(n=3)

-:no data;the numbers denoted were the same as those in Table 1

3 结 论

本文建立了舒血宁注射剂中16个黄酮醇苷和4个萜类内酯同时定量的UPLC-MS/MS分析方法。相比传统酸解定量黄酮苷元及黄酮、内酯的方法，本方法可在10 min内完成样品中20种化合物的同时测定，方法简单快速、重现性好，适于舒血宁注射剂中多种黄醇酮苷和萜类内酯的同时定量，为其深入的质量研究奠定了基础。