瑞芬太尼预处理对脑缺血再灌注损伤老年大鼠血小板衍生因子、髓鞘碱性蛋白表达的影响

刘姝 周金凤 曾宪晶 祝美珍 俞睿

(井冈山大学附属医院 1麻醉科，江西 吉安 343000；2中医科；3广西中医药大学基础医学院)

脑血管疾病目前已经成为中国中老年人群致死、致残的主要疾病之一，其中缺血性脑卒中最为突出，约占脑血管疾病的70%〔1〕。而脑缺血再灌注(I/R)损伤则是缺血发生一定时间后再次恢复血流灌注，但在多数情况下，缺血后再灌注不仅没有使脑组织功能恢复，反而进一步加重缺血导致的结构破坏和功能障碍〔2〕，是引起脑血管病恶化的重要机制之一，有效干预I/R损伤是防治脑损伤进一步加剧的重要环节。研究证实〔3～5〕，使用瑞芬太尼预处理的动物可有效减轻心、肝、肾等器官再灌注损伤程度，其中关于脑I/R保护的相关机制鲜有报道，有研究表明〔6，7〕瑞芬太尼预处理与脑保护之间存在相互关系，但未进一步述及具体机制。本实验观察瑞芬太尼预处理对I/R损伤大鼠脑组织血小板衍生因子(PDGF)、髓鞘碱性蛋白(MBP)表达的影响并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1试验动物与造模方法 健康SPF级SD大鼠50只，15～24月龄，随机分为空白组5只，假手术组、脑I/R组、瑞芬太尼预处理组各15只，体重(350±50)g，从广西医科大学动物实验中心购入(生产许可证号：SCXK桂2003-0003，使用许可证号：SYSK桂2003-0005)，在本校动物实验房适应性喂养1 w后，参照longa法〔8〕制备大鼠中脑动脉闭塞(MCAO)模型，术后2 h拔出栓线约10 mm，恢复血流，制成大鼠急性脑I/R损伤模型。造模成功后以上各组按术后2 h I/R不同处死时间点6 h、12 h、24 h分为3个亚组，每组5只。假手术组：仅行左侧颈总动脉分离，未行插线不结扎也不做缺氧缺血处理。瑞芬太尼预处理组：在行MCAO手术前2 h经股静脉注入瑞芬太尼(人福医药公司，批号：6180309)，给药剂量参照文献〔9〕中大鼠换算的标准方程计算，每次输注5 min，连续3次，输注速率为1.0 μg/(kg·min)，每次输注完后给予5 min间歇期，整个预处理过程约30 min。I/R组：操作步骤同瑞芬太尼预处理组，输注等量生理盐水代替瑞芬太尼。大脑MCAO模型制作成功的标准：①患侧右前爪部分屈曲或完全屈曲；②行走时身体向偏瘫侧转圈；③行走时身体向偏瘫侧跌倒。

1.2采样制作 大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，剪开胸腹腔，暴露心脏，通过心脏快速灌注约100 ml生理盐水，灌洗至肺脏变白，右心耳流出清亮液体后，再灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)约150 ml固定，至大鼠尾巴及四肤强直僵硬后，撬开颅骨，完整取脑放入生理盐水中漂洗残血后，置于4% PBS中固定。24 h后脑组织取出切块，经不同梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，用切片机制作约4 μm厚度的冠状切片，常规HE染色后，光镜下观察缺血侧脑组织神经细胞形态病理变化。

1.3指标检测 免疫组化操作步骤：取出上述包埋切片脱蜡，柠檬酸热修复10 min，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶20 min；封闭血清37℃中水浴30 min，滴加山羊血清50 μl/片，37℃封闭内源性生物素20 min；滴加一抗1∶100，50 μl/片，40℃20 h；滴加生物素标记的二抗50 μl/片，室温30 min；滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素50 μl/片，37℃ 30 min；上述每步骤间均用PBS漂洗5 min×3次，二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。在10×40倍光镜下观察胞质有棕色颗粒者为阳性细胞，每张切片随机选取观察5个视野，计算阳性细胞数，取平均值。

1.4统计方法 采用SPSS19.0软件，成组设计多样本均数的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA检验)，多样本均数组间比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1HE染色结果 空白组、假手术组：大鼠神经元形状完整，多层密集排列，胞膜呈圆或椭圆形，核仁明显，核染色质清晰均匀。I/R组：镜下神经细胞数目减少，再灌注6 h时胞体肿胀，排列不齐，局部缺血周围区水肿明显，细胞肿胀，疏松淡染；再灌注24 h时神经元坏死和凋亡明显，水肿、肿胀减轻，胞体缩小，见大量固缩变性坏死神经细胞，细胞核消失，部分区域核固缩深染，边缘区炎性细胞浸润，胞质内形成微空泡，胶质细胞增生。瑞芬太尼预处理组再灌注6 h时细胞多层密集，胞膜较完整，水肿不明显，再灌注24 h时神经元部分胞体缩小，色深染，周围见少量固缩坏死神经元，炎性细胞浸润及少量胶质细胞增生，较I/R组病理改变减轻。见图1。

2.2神经功能缺损评分 MCAO术后，空白组与假手术组神经功能评分均无明显改变(P>0.05)。I/R组和瑞芬太尼预处理组在术后均出现不同程度的神经功能缺损症状，与I/R组相比，瑞芬太尼预处理组神经功能缺损评分减轻(P<0.05)，见表1。

表1 各组脑I/R各时间点神经功能缺损评分(分，

与空白及假手术组比较：1)P<0.01；与I/R组比较：2)P<0.05

2.3PDGF、MBP阳性细胞表达 MCAO术后，与空白组、假手术组、I/R组比较，瑞芬太尼预处理组PDGF阳性细胞表达在各时间点均明显升高(P<0.01)，I/R组PDGF阳性细胞表达与空白组、假手术组相比无显著差异性(P>0.05)。I/R组MBP阳性细胞表达数其他与各组比较明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组I/R各时间点PDGF、MBP阳性细胞数表达(个/视野，

与瑞芬太尼预处理组比较：1)P<0.01;与I/R组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

3 讨 论

瑞芬太尼作为一种新型的超短效型阿片受体激动剂，是麻醉和镇痛中常用药物，已在临床广泛应用，作为神经传递素的抑制剂，易透过血脑屏障，快速达到血-脑平衡，药物吸收后广泛分布于整个中枢神经系统，为脑损伤治疗提供药动学基础。脑缺血发生后，随着氧自由基大量释放、钙超载及谷氨酸受体激活等各种因素相互作用下，激活细胞凋亡转导通路，最后导致细胞死亡〔10〕。在脑损伤过程中，MBP作为抗原激活免疫系统，缺血性脑损伤引起中枢神经系统髓鞘断裂崩解，MBP释放可诱导炎症反应的发生〔11〕，启动炎症损伤级联反应程序，随着血流再灌注，神经细胞损伤进一步加重，加速细胞凋亡。研究表明MBP对神经元的神经毒性作用主要是由其强碱性决定的，这种强碱性使得MBP可以广泛结合于神经元膜表面，从而直接损伤神经元质膜，造成离子紊乱及细胞内容物外漏，离子稳态失衡，最终导致神经元凋亡〔11〕。研究〔12〕证实其过量表达与神经损伤呈正相关。MBP 表达水平反映了中枢神经系统有无实质性损害，特别是有无髓鞘脱失的一个较为特异性的生化指标，其含量水平反映了损害范围的严重程度〔13〕。本实验瑞芬太尼预处理组MBP表达水平明显低，其机制可能是通过减轻MBP表达水平来达到脑保护，与临床报道一致〔14〕。

PDGF是一种具有分裂能力和对细胞有增殖作用的因子，主要对特定细胞群起刺激作用，并且可以促进有丝分裂，在控制细胞迁移分化方面有显著意义。研究结果表明：PDGF-二聚体结构(BB)是针对PDGF受体-β的最高亲和配体，能促进内皮细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞和纤维细胞增长和繁殖〔15〕。可加速细胞外基质蛋白和胶原蛋白的形成，促进损伤区修复。PDGF还是神经元及其角质细胞的重要生长因子，可以发挥营养神经、调节血管张力、促进血管生长等作用，在急性脑梗死患者康复治疗中具有重要意义〔16〕。本实验中瑞芬太尼预处理组脑组织PDGF含量增高，其原因可能与刺激脑组织细胞产生PDGF表达增加有关，有研究表明其通过介导磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的激活发挥作用〔17〕。

综上，瑞芬太尼在I/R早期可能通过干预炎症损伤级联反应程序，刺激神经细胞的迁移增殖分化，发挥营养神经、调节微血管生成作用。瑞芬太尼预处理可以减轻大鼠脑I/R损伤程度，减轻神经元坏死和凋亡，具有一定的神经保护作用。