促红细胞生成素衍生物螺旋B表面肽对表柔比星所致大鼠心肌损伤的影响

于秀燕 李跃荣 赵冬冬 刁树玲 李花 郭纪伟 马宝新

(滨州医学院附属医院 1心内科，山东 滨州 256600；2肿瘤科；3滨州医学院肿瘤研究实验室)

表柔比星(EPI)是蒽环类化疗药物新的衍生物，在临床上主要用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌等多种恶性肿瘤。但蒽环类药物化疗的心脏毒性是累积性的，从而限制了许多晚期疾病患者的治疗选择〔1〕。促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白，主要由成年肾脏产生。EPO已经被证明具有许多非造血功能，包括减少细胞凋亡，抑制炎症反应，促进血管生成，加速组织功能恢复等。然而，EPO会引起一系列不良反应，如增加血液黏度、升高血压和引起血栓形成等，严重限制了其在临床中的应用。EPO衍生物螺旋B表面肽(HBSP)，它不具有EPO的促红细胞生成素效应，避免了上述副作用，但具有与EPO相当的心脏保护作用〔2，3〕。本研究通过建立EPI心肌损伤模型大鼠，并给予EPO及其衍生物HBSP进行治疗，验证EPO及HBSP对EPI诱发的心肌损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1试剂 EPI购自海正辉瑞制药有限公司；重组人促红细胞生成素(rhEPO)购自昂德生物药业有限公司；HBSP(纯度>98%)购自上海科肽生物科技有限公司；大鼠心肌肌钙蛋白(cTn)I试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Casepase-3和Bcl-xl抗体及羊抗兔多克隆二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司；山羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2动物分组及造模 健康Wistar大鼠40只，体重(280±20)g，雄性，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，随机分为四组。对照(CON)组、EPI处理(EPI)组：给予腹腔注射EPI 2.5 mg/kg，每周1次，共6 w，累积剂量15 mg/kg；EPI+EPO组：腹腔注射rhEPO 5 000 IU/kg，每周3次，分别为EPI给药前1 d，给药后第1天及给药后第3天，共6 w；EPI+HBSP组：腹腔注射HBSP 60 μg/kg，给药时间同EPO组。余均予以等量生理盐水腹腔注射6 w，每组10只。于第11周处死大鼠。

1.3血细胞计数 大鼠处死前采集内眦静脉血进行血涂片，瑞氏-吉姆萨染色，待干后即可镜检，采用中性树胶固定。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA) 于第11周在大鼠内眦静脉采血2 ml，3 000 r/min，离心5 min，分离出血清，取上清液保存于-80℃冰箱，使用ELISA试剂盒检测血清中cTnI水平。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠后，经心脏左心室处插管灌注磷酸盐缓冲液(PBS)和4%多聚甲醛，固定取心尖组织，经4%多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，制成蜡块，切片行HE染色，厚约4 μm。经脱蜡、水化、封片等HE染色操作后，通过光学显微镜观察心脏组织病变。

1.6免疫组化测定 心肌组织经过4%多聚甲醛液固定、包埋、切片、脱蜡、乙醇脱水后，微波修复抗原，冷至室温，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS洗，血清封闭后滴加一抗，Caspase-3、Bcl-xl浓度分别为1∶100、1∶200，放置4℃过夜，加二抗，滴加二甲基联苯胺(DAB)显色液，苏木精复染、脱水、透明、封片。置于200倍光学显微镜下观察左心室心肌组织，并用Image Pro Plus6.0图像分析软件测定心肌组织中Caspase-3和Bcl-xl蛋白表达的平均光密度 (IOD/area)，并进行统计分析。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组血细胞计数比较 与CON组比较，EPI组大鼠红细胞、白细胞及血小板计数明显减少(P<0.05)，与EPI组比较，EPI+EPO组大鼠红细胞计数明显增多(P<0.05)，白细胞及血小板计数无明显变化(P>0.05)，EPI+HBSP组大鼠红细胞、白细胞及血小板计数均无明显变化(P>0.05)。见表1。

2.2各组血清cTnI水平比较 与CON组cTnI水平〔(659.57±28.28)pg/ml〕比较，EPI组大鼠血清中cTnI水平增加〔(1263.22±20.70)pg/ml,P<0.05〕。与EPI组比较，EPI+EPO组〔(884.83±23.65)pg/ml〕和EPI+HBSP组〔(755.55±20.67)pg/ml〕血清中cTnI水平下降，尤以EPI+HBSP组效果明显(P<0.05)。

表1 各组大鼠血细胞计数比较

与CON组比较：1)P<0.05；与EPI组比较：2)P<0.05，下表同

2.3各组心肌组织病理学检测 与CON组比较，EPI组可见部分心肌细胞水肿、呈空泡样变性，心肌纤维断裂，排列紊乱，呈灶状或片状坏死；心肌细胞间隙明显增宽，间质中可见炎性细胞浸润。与EPI组比较，EPI+EPO组及EPI+HBSP组上述形态学改变明显较轻，炎性细胞浸润有一定程度改善。EPI+EPO组与EPI+HBSP组差异不明显。见图1。

图1 各组心肌组织HE染色(×200)

2.4各组心肌组织Caspase-3和Bcl-xl表达 Caspase-3及Bcl-xl蛋白阳性表达主要位于胞质，也有部分在胞质和胞核均着色，呈棕黄色。与CON组比较，EPI组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)，Bcl-xl蛋白表达显著降低(P<0.05)；与EPI组比较，EPI+EPO组及EPI+HBSP组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-xl蛋白表达显著升高(P<0.05)。EPI+EPO组与EPI+HBSP组之间的差异不明显(P>0.05)。见图2、图3，表2。

图2 各组心肌组织Caspase-3蛋白表达(DAB，×200)

图3 各组心肌组织Bcl-xl蛋白表达(DAB，×200)

表2 各组心肌组织Caspase-3、Bcl-xl蛋白表达

3 讨 论

蒽环类是一种高效的化疗药物，在临床上主要用于治疗各种恶性肿瘤，但其心脏毒性是蒽环类药物治疗的一个公认的副作用〔1〕。急性毒性发生在治疗过程中或治疗后数天内，主要为心电图的改变。慢性毒性发生在治疗后数周至数年，多出现不可逆性改变，包括心肌病和充血性心力衰竭。迟发性心脏毒性反应甚至可能出现于化疗后多年之后，即使以低剂量给药，据报道这些药物也会引起进行性心脏功能障碍〔4～6〕。柔红霉素、多柔比星(阿霉素)是两种早期的蒽环类抗肿瘤药物。EPI作为蒽环类药物新的衍生物，并未表现出较强的治疗效果和较低的心脏毒性〔7，8〕。这不但限制了在临床中的应用，影响了治疗效果，而且明显影响了肿瘤患者的生活质量。

EPO是具有多效性的细胞因子，被广泛用于治疗肿瘤患者化疗药物诱发的贫血。研究显示EPO可通过标准EPO受体降低肿瘤患者生存率〔9，10〕。然而，EPO会引起血液黏度增加、血压升高和引起血栓形成等一系列副作用，严重限制了其在临床中的应用。HBSP既保留了EPO的组织保护活性又避免了EPO的副作用。本研究通过建立EPI致心肌损伤大鼠模型，发现EPI给药后大鼠出现骨髓抑制，表现为红细胞、白细胞、血小板三系降低，可以延续至停药后。EPO可明显促进EPI心肌损伤大鼠的红系造血功能的恢复，这可能与EPO促进造血细胞增殖分化的作用有关，而HBSP无刺激造血作用。cTnI在反映心肌损伤方面具有较高的灵敏度及特异性，EPI给药后大鼠心肌组织中cTnI明显升高，给予EPO及HBSP干预后，大鼠心肌组织中cTnI明显降低，表明EPO及HBSP可明显减轻心肌损伤。

Caspase-3、Bcl-xl是与细胞凋亡密切相关的蛋白，其中是Caspase-3细胞凋亡信号通路中的关键蛋白酶，在细胞凋亡中起着中心环节的作用，是细胞凋亡的执行者〔11，12〕。Bcl-xl是Bcl基因家族成员之一，作用机制可能是通过阻止线粒体释放细胞色素C起到抑制细胞凋亡的作用，从而阻断上游Caspase蛋白酶的激活，抑制细胞凋亡〔13〕。本研究发现EPI组大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Caspase-3 的表达明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达明显下降。给予EPO及HBSP干预后，大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表达明显下降，抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达明显升高。

综上所述，EPO及HBSP通过凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-xl的表达发挥抗凋亡作用，减轻心肌损伤，改善心功能，从而发挥心脏保护作用。但本研究未能阐明HBSP下调Caspase-3、上调Bcl-xl蛋白表达的具体信号通路途径及作用的受体位点，有望进一步的深入研究。