七氟烷与异氟烷麻醉对脑胶质瘤患者外周血细胞因子的影响

姜虹宇 吕忆松 张桂运 韩骢 徐远志 时飞

(1无锡第三人民医院麻醉科，江苏 无锡 214000；上海交通大学 2继续教育学院；3附属第一人民医院神经外科)

多形性胶质母细胞瘤属恶性实体瘤〔1〕，预后极差。目前，胶质瘤标准化治疗方案为手术切除联合放、化疗，即使是现阶段的联合方案也仅能延长中、晚期患者2～4个月的生存期〔2〕。美国临床肿瘤学会2016年将免疫治疗作为最重要的癌症治疗，这将根本改进恶性实体肿瘤的治疗策略〔2，3〕。不同的麻醉药物对恶性肿瘤细胞的肿瘤微环境的影响逐渐被发现，并对肿瘤患者的后续治疗及康复方案制定都有密切影响〔3〕。随着进一步的研究，逐渐发现吸入性麻醉药物对外周血细胞因子也有重要影响。七氟烷、异氟烷为临床常用的吸入麻醉诱导药物，丙泊酚则是最常见的静脉麻醉药物〔3〕。对于神经系统恶性肿瘤切除手术来说，不仅需要长时间的稳定、可靠的麻醉，还需要减少对于内环境干扰及细胞免疫状态损害，从而降低恶性肿瘤播散的可能性。研究发现，七氟烷在体外具有抑制肺癌细胞增殖和转移的能力〔4～6〕。本研究拟探讨吸入麻醉药物对脑胶质瘤患者外周血细胞因子表达的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 本研究经无锡第三人民医院伦理委员会批准，入选患者术前均签署知情同意书。2015年1月至2018年8月神经外科收治的美国麻醉医师协会(ASA)Ⅰ～Ⅱ级且无心血管疾病的肿瘤确诊患者36例，男22例，女14例；随机分成七氟烷组(S组)，异氟烷组(I组)及全静脉对照组(C组)各12例。排除标准：体重指数(BMI)>30 kg/m2；临床上发现其他转移；有内分泌及免疫系统疾病史；有肿瘤放化疗病史；激素及免疫抑制剂应用史。各组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组一般情况比较

1.2诱导麻醉方案 常规术前禁食、水10 h，无术前用药。入室后常规开放静脉通道，检测动脉压和心率，脑电双频指数等。S组在诱导前15 min，麻醉诱导剂丙泊酚模式输注 1.5 μg/ml，咪达唑仑0.1 mg/kg。气管插管后连接呼吸机机械通气。I组基本同S组，诱导后吸入异氟烷维持麻醉，开启异氟烷或七氟烷维持麻醉，呼气末浓度维持1.5～2.0 MAC。气流量为2 L/min，均静脉输注瑞芬太尼镇静。C组则仅使用丙泊酚，靶控浓度控制在3～4 μg/ml。术中根据引流量和尿量等计算液体损失量，以等量的乳酸钠林格溶液进行补充。3组手术过程中生命体征及出入量差异无统计学意义。手术由同一治疗小组医师进行，以尽量减少人为误差。

1.3标本收集 3组分别于手术结束即刻 (T1)经颈内静脉抽取15 ml血样，放入肝素钠真空试管。同理在术后第3天 (T2)和第1周(T3)再次抽取外周血，离心分离血清，放入无菌试管根据要求储存。

1.4CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)流式细胞检测 首先2 000 r/min离心10 min后分离出血清，将抗凝后取全血标本100 μl，分别加入PE标记的CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD25-活化蛋白(AP)C各20 μl，室温暗室孵育25 min。加入溶血素，振荡混匀。固定细胞后，按照操作要求进行破膜，加入20 μl FoxP3-PE，混匀，按要求室温暗室孵育。离心后弃上清液，经过磷酸盐缓冲液洗涤后进行混匀操作，下一步运用流式细胞仪进行复分析计数(FACS Calibur，美国BD公司)。数据分析获得CD4+CD25+T 细胞的百分数。

1.5酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测细胞因子 检测白细胞介素(IL)-2和IL-10水平，按照试剂盒(购自美国BD公司)说明进行操作。

1.6实时荧光-聚合酶链反应(RT-PCR)检测 FoxP3 mRNA表达 收集外周血细胞按照 RT-PCR 试剂盒方法提取 RNA。 根据数据库GenBank (NM-014009)中 FoxP3+的序列设计引物：上游：5′-GAACGCCATCCGCCACAACCTGA-3′，下游：5′-CCCTGCCCCCACCACCTCTGC-3′。循环条件根据要求进行。

1.7核因子(NF)-κB检测 使用NF-κB通路专用芯片(购自Full moon公司)检测下游NF-κB表达情况。按照厂商配置的操作手册进行提取及标记，后进行芯片杂交，杂交后干燥放置。使用GenePix Pro6.0软件分析结果。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、秩和检验。

2 结 果

2.1外周血T细胞亚群的检测 T2时S组外周血CD4+CD25+T细胞比例较I组和C组显著减少(P<0.05)，而T1及T3时间点3组比较无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组各时间CD4+CD25+T检测结果

与S组比较：1)P<0.05;表3、4同

2.2细胞因子的表达 3组各时间点IL-2表达未见明显差异(P>0.05)；而S组IL-10在T2时显著低于C组(P<0.05)，T1及T3无明显差异(P>0.05)。见表3。

表3 3组各时间点血浆IL-2、IL-10 水平

2.3外周血FoxP3 mRNA表达 I组及S组外周血细胞中均发现FoxP3 mRNA 表达，S组表达较I组有明显降低。C组外周血细胞未见FoxP3 mRNA 表达。见图1。

图1 3组各时间点外周血FoxP3 mRNA表达

2.4NF-κB表达检测 T1、T3时3组NF-κB表达差异无统计学意义(P>0.05)。T2时，C组和I组间NF-κB表达没有明显差异(P>0.05)，而S组NF-κB表达显著高于C组、I组(P<0.05)。见表4。

表4 各组各时间NF-κB检测结果

3 讨 论

外界的各种刺激、应激均是影响围术期患者预后的重要因素，也与机体免疫状态息息相关；肿瘤发生、发展意味着机体的免疫系统发生了重大变化。研究认为，全身麻醉药物可能对免疫系统产生明显影响，从而对肿瘤患者治疗及预后产生重要影响〔4〕。研究发现，麻醉方法或麻醉药物对肿瘤患者内环境一系列指标均发生影响〔5〕，同时也有研究在胃癌等其他癌症里发现麻醉方法或麻醉药物对细胞因子的影响〔3〕。

静脉血能够真实地反映外周血细胞因子〔5，6〕。丙泊酚是广泛运用于临床的静脉麻醉药物，起效迅速，可应用于诱导麻醉及不同深度维持〔7～9〕。七氟烷、异氟烷主要通过呼吸道及肺部代谢，无刺激性，临床应用广泛。

抗肿瘤免疫反应驱动了传统治疗联合免疫治疗策略的发展。Treg 是一类具有免疫抑制功能的细胞群，特征性表达转录因子FoxP3〔10〕。在胸腺内Treg 细胞经过发育成熟后特异性表达FoxP3+，具有免疫抑制功能〔11〕。Treg 细胞数量增加和其所占比例的增高，提示对机体免疫发挥抑制功能，导致对肿瘤生长的抑制能力降低，从而可能导致肿瘤进展。

本文发现，Treg细胞主要通过以下几个方面发挥抑制作用：分泌IL-10 来抑制 CD4+T 细胞活化和增殖〔10，11〕；通过FoxP3-miR146-NF-κB 轴来实现调控〔12〕。本研究确认了胶质瘤患者体免疫抑制功能的CD4+CD25+T 细胞比例明显增高，肿瘤患者外周血RT-PCR检测显示其高表达FoxP3。

肿瘤细胞的逃逸可能与免疫抑制相关的因子分泌和免疫抑制通路启动有关〔13〕。研究提示，手术引起的免疫抑制状态在术后几小时内至持续几天不等〔13，14〕。术后打击的免疫抑制会打破原先免疫系统和肿瘤细胞之间的平衡，从而导致肿瘤复发转移。对于麻醉，不仅需要减少术中的应激，而且需要减少麻醉药物可能造成的免疫抑制功能〔12，13〕。

本研究说明，现有的麻醉方案对于肿瘤的负荷，麻醉的应激都没有明显加重，而七氟烷作为吸入麻醉药物还有围术期减轻免疫抑制的可能性。

NF-κB作为转录调节因子，可因DNA损伤在内的多种因子激活被上调，对细胞的代谢生存、细胞凋亡与肿瘤细胞的生长起着重要作用〔14〕。而通过检测发现NF-κB升高与FoxP3表达降低相关，考虑可能与NF-κB-FoxP3的调节轴有关，目前在神经肿瘤方面未见相关研究，还需进一步的研究。

综上，七氟烷吸入麻醉可能比异氟烷更适合脑胶质瘤患者的手术诱导。