根尖牙乳头干细胞摄取外泌体的介导途径

高晓敏，邹晓英，岳 林

(北京大学口腔医学院·口腔医院，牙体牙髓科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)

外泌体是机体内大部分细胞都能分泌的一种直径在30～150 nm的微囊泡[1]。20世纪80年代发现外泌体时，最初认为它是细胞为了维持自身稳定状态向外排泄废物的途径[2]。20世纪90年代末，Raposo等[3]发现，人和鼠来源的B淋巴细胞外泌体含有组织相容复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ)分子，可以诱发T淋巴细胞的免疫反应, 提示外泌体在信号传导方面具有重要意义。2007年，Valadi等[4]通过体外实验研究发现，小鼠MC/9细胞来源的外泌体内含有RNA成分，能够转运至受体细胞中表达产生蛋白质，并发现由于外泌体存在膜包被，外泌体的RNA成分能够抵抗RNA消化酶的降解作用,这进一步说明外泌体介导细胞间信号信息传导的重要作用。

随着组织再生工程学的发现，人们逐渐注意到外泌体所携带的信号分子有助于干细胞的定向分化。2016年Huang等[5]发现，牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)和骨髓间充质干细胞可以摄取DPSCs外泌体，外泌体可以促进二者向成牙本质向分化。2018年，Xian等[6]的研究发现人脐带静脉内皮细胞同样可以摄取DPSCs外泌体，且外泌体可促进人脐带静脉内皮细胞的增殖、促血管生成因子的表达以及增强其小管的形成，提示牙髓干细胞外泌体在促进牙髓再生方面具有潜能。2014年，Liu等[7]发现基质细胞衍生因子可以促进根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)的迁移，为诱导根尖组织的干细胞进入根管内提供了新的方案,但如何诱导SCAP向成牙本质向定向分化仍是实现牙髓牙本质复合体再生的关键问题，SCAP能否摄取DPSCs外泌体并利用其信号实现定向分化尚不明确。

本研究目的是探讨SCAP对DPSCs外泌体的摄取作用及摄取的介导途径，为揭示其内吞外泌体的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 DPSCs外泌体的提取与鉴定

1.1.1分离培养DPSCs、SCAP 收集北京大学口腔医院颌面外科门诊因阻生或正畸需要而拔除的前磨牙或第三磨牙。本研究获得北京大学口腔医院医学伦理委员会批准(PKUSSIRB-201412020)。离体牙纳入标准：患者18～25岁，牙齿完整、无龋损、无牙髓或根尖周炎症、无牙周疾病，供者身体健康，自愿签署知情同意书。本研究选用根尖牙乳头干细胞供者为18岁男性左下第三磨牙、21岁女性右下第三磨牙、22岁男性右下第三磨牙；牙髓干细胞供者为24岁女性左下第二前磨牙、18岁男性右下第一前磨牙、20岁女性右上第二前磨牙。于超净台中切取离体牙根尖的牙乳头组织，使用咬骨钳钳碎患牙并取出牙髓组织。将上述组织分别切碎至1 mm×1 mm×1 mm，用3 g/L的Ⅰ型胶原酶(Worthington公司，美国)和4 g/L 分离酶(Sigma公司，美国)，37 ℃ 消化30～40 min。将消化后的细胞悬液过70 μm 细胞筛，以获得单细胞悬液。将单细胞悬液加入6 孔板(Corning公司，美国)中，加入含有15%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%(体积分数)L-谷氨酰胺及1%(体积分数)青-链霉素(Gibco公司, 美国)、88% αMEM(α minimum Eagle’s medium，Hyclone公司, 美国)的普通培养基，置于5%(体积分数)CO2，37 ℃ 培养。待细胞长满至75%时，将原代细胞按照1 ∶3 传代，至第3～4 代细胞备用。

1.1.2提取DPSCs外泌体 将胎牛血清在4 ℃条件下100 000×g超速离心12 h以去除胎牛血清中的外泌体。取第3代DPSCs细胞以1×107个细胞/孔接种于175 cm2培养瓶中，采用含有10%(体积分数)胎牛血清的普通培养基培养至5 d后，弃去上清，更换为不含外泌体的细胞培养基继续培养2 d，收集上清液。将收集好的上清液转移至50 mL离心管。以下离心步骤均在4 ℃条件下完成：以300 ×g转速离心10 min(除去上清液中的细胞)；将上清液转移至50 mL洁净离心管，以2 000 ×g的转速离心10 min(除去上清液中的死细胞)；将上清液转移至50 mL洁净离心管，以10 000 ×g的转速离心30 min(去除上清液中的细胞碎片)后收集上清液。采用相对分子质量10 000 的孔径超滤管(Millipore，sigma公司，美国)对离心后的上清液进行超滤浓缩，将浓缩后的上清液加入超速离心机(Optima XPN-10，Backman公司，美国)配套的离心管，100 000×g超速离心70 min。离心结束后，弃去上清液，加入0.5 mL PBS重悬沉淀，获得提取物悬液，置于-80 ℃保存。

1.1.3DPSCs外泌体的鉴定 透射电镜观察提取物形态：将10 μL提取物悬液，用50 μL 2%(体积分数)多聚甲醛室温固定30 min，取上述混合液8 μL，滴加至碳涂层铜网格上，风干10 min，再用1%(体积分数)醋酸双氧铀染色两次，每次6 min。将铜网装入透射电镜(JEM-1400，JEOL公司，日本)， 电压设置为120 kV，观察提取物形态。粒径分布：取1 mL 提取物悬液，采用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)用于确定粒径分布。使用纳米粒子跟踪分析仪(NS3000，Malvern公司，英国)记录布朗运动下外泌体的运动轨迹，并通过NTA分析软件进行分析。Western blot检测外泌体标志蛋白：取50 μL提取物悬液，加入20 μL的1%(质量分数)Triton裂解液，冰上裂解30 min，超声破碎1 min。4 ℃ 12 000 r/min离心30 min提取蛋白，BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)检测蛋白浓度，记录结果。100 ℃ 水浴 5 min，配胶(12% SDS-PAGE，碧云天公司，中国)， 15 μL蛋白上样，蛋白分离2 h (电泳电压为125 V)， 切胶；1.5 h后蛋白转移到 PVDF膜(Millipore Corporation公司，美国)上(转膜电压为100 V)；脱脂牛奶封闭1 h；加入一抗CD63(1 ∶500，ab68418，Abcam公司，美国)/TSG101(1 ∶500，14497-1-AP，Proteintech公司，美国)/GAPDH(1 ∶500，10494-1-AP，Proteintech公司，美国) 4 ℃ 孵育过夜；用TBST 洗膜3次，每次10 min；用抗兔IgG抗体(1 ∶1 000，10285-1-AP，Proteintech公司，美国)孵育1 h； TBST 洗膜3次，每次10 min；应用学发光检测试剂盒(Proteintech公司, 美国), 凝胶成像系统(Vilber Lourmat公司, 美国)曝光。

1.2 SCAP对DPSCs外泌体的摄取

1.2.1PKH-26标记DPSCs外泌体 采取PKH-26(一种亲脂性染料，可以稳定地与细胞膜脂质区结合并发出荧光)膜标记技术标记DPSCs外泌体。将1 mL 10 mg/L(根据第1.1.3小节测定的蛋白浓度稀释)的外泌体重悬液加入1 mL 稀释液C(Sigma公司，美国)中，同时将4 μL的PKH-26(Sigma公司，美国)加入1 mL的稀释液C中，将两份溶液混合，共孵育4 min，而后加入2 mL 0.5% (质量分数)BSA中和未结合的染液，采用 0.5% BSA溶液中和未标记外泌体的PKH-26染料作为阴性对照组。将标记好的外泌体加入PBS中，100 000×g转速下离心70 min(4 ℃)，弃去上清液，将沉淀用PBS重悬。

1.2.2SCAP对DPSCs外泌体的摄取作用 取第3代细胞以5×103个细胞/孔接种于圆形盖玻片，待细胞培养至80%汇合时，将第1.2.1小节中获得的重悬液加入SCAP的培养基中，分别在37 ℃和4 ℃与SCAP共培养6 h。6 h后收集样本，PBS冲洗两遍，加入4%(体积分数)多聚甲醛固定液(Solabrio公司，中国)固定10 min，PBS冲洗3遍。加入含有4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(4’,6-diamino-2-phenylindole，DAPI，Sigma公司，美国)的封片液封片，激光共聚焦显微镜下观察SCAP内PKH-26的表达情况。

1.3 摄取过程依赖的胞吞途径

1.3.1分组 采用不同胞吞抑制剂分别抑制网格蛋白依赖、小窝蛋白介导和巨胞饮依赖途径。(1)氯丙嗪(chlorpromazine，CPZ)组：采用10 μmol/L 网格蛋白依赖胞吞途径抑制剂CPZ处理SCAP。(2)Genistein组：采用200 μmol /L 小窝蛋白介导胞吞途径抑制剂genistein处理SCAP。(3)LY294002组：采用50 μmol /L 巨胞饮依赖胞吞途径抑制剂LY294002处理SCAP。(4)溶剂对照组：采用与抑制剂组等量的溶剂DMSO处理SCAP作为对照。

1.3.2免疫荧光染色 取第3代细胞以5×103个细胞/孔接种于圆形盖玻片上，待细胞培养至80%汇合时，按照上述分组，各组采用相应培养液预处理SCAP 30 min(后续实验一直存在于培养液中)， 将PKH-26标记好的DPSCs外泌体(10 mg/L)加入各组SCAP的培养基中。37 ℃共培养6 h后收集样本，采用PBS冲洗3遍，加入4%(体积分数)多聚甲醛固定液固定10 min，PBS冲洗3遍。加入含有DAPI的封片液封片，激光共聚焦显微镜下观察SCAP内红色荧光表达。

1.3.3流式细胞分析术 取第3代细胞以5×104个细胞/孔接种于6孔板，待细胞培养至80%汇合时，按照上述分组，各组采用相应培养液预处理SCAP 30 min(后续实验一直存在于培养液中)，将PKH-26标记好的DPSCs外泌体(10 mg/L)加入各组SCAP的培养基中。37 ℃共培养6 h后收集样本，将SCAP消化下来后PBS冲洗3遍，离心弃上清液，采用0.5%(质量分数) BSA溶液重悬细胞，300 μm细胞筛过滤细胞形成单细胞悬液，应用流式细胞仪(Aria Sorp，Becton, Dickinson公司，美国)检测红色荧光标记的根尖牙乳头干细胞百分比。

2 结果

2.1 人DPSCs、SCAP的形态特征

经酶消化法体外分离培养的人DPSCs、根尖牙乳头细胞生长良好，呈梭形、多角形等典型的成纤维细胞样形态，细胞大小基本一致(图1)。原代培养约5 d后DPSCs(图1A)、SCAP(图1C)可见克隆集落形成，待各集落细胞逐渐汇合后可见DPSCs(图1B)、SCAP(图1D)排列整齐，呈漩涡状生长。

2.2 DPSCs来源外泌体的特征

采用多步离心法结合超滤法提取细胞上清液中的外泌体，透射电镜下可以观察到DPSCs外泌体呈茶托样，具有双层膜结构图(图2A、B)。纳米粒子示踪分析技术检测DPSCs外泌体粒径峰值为 144nm(图2C)。Western Blot检测DPSCs外泌体表达外泌体特征标志膜结合蛋白TSG101和四跨膜蛋白超家族CD63，不表达细胞内参蛋白GAPDH(图2D)。

2.3 SCAP对DPSCs外泌体的摄取

将PKH-26标记后的DPSCs外泌体与SCAP共培养后采用激光共聚焦显微镜观察SCAP对DPSCs外泌体的摄取作用,可见蓝色标记的是细胞核。阳性组在37 ℃条件下共培养6 h后可见大量红色荧光(PKH-26)围绕在细胞核周围(图3)，而4 ℃条件下共培养6 h后SCAP则未见明显红色荧光(PKH-26)标记(图3),同时未添加外泌体的阴性对照组未见红色荧光(PKH-26)标记(图3)。

2.4 SCAP摄取DPSCs外泌体的介导途径

为考察SCAP摄取外泌体的介导途径，本研究设计了三种胞吞抑制剂CPZ、Genistein和LY294002，抑制SCAP的胞吞过程后进一步观察不同的胞吞途径对SCAP摄取外泌体的影响，代表性染色结果见图4。溶剂对照组SCAP细胞核周围存在大量红色荧光(PKH-26)标记(图4)，与阳性组(图3)基本一致，而采用胞吞抑制剂对SCAP进行处理后，将PKH-26标记的DPSCs外泌体与SCAP共培养6 h后，CPZ组、Genistein组细胞核周围红色荧光(PKH-26)标记量明显下降， LY294002组细胞核周围红色荧光(PKH-26)标记量有少量下降(图4)。流式细胞分析结果(图5)显示阳性对照组中摄取外泌体的SCAP占35%，阴性对照组中有红色荧光标记的SCAP占比0.5%。溶剂对照组中有红色荧光标记的SCAP占比 29.7%，而CPZ、Genistein、LY294002处理SCAP后，红色荧光标记的SCAP占比分别下降至13.7%、16.6%、20.9%，与上述免疫荧光染色的结果趋势是一致的。

3 讨论

采用酶消化法分别从根尖牙乳头组织、牙髓组织中提取培养SCAP、DPSCs，经刘敬一等[8]采用流式细胞鉴定显示，分离培养的DPSCs、SCAP均表达间充质干细胞特征标志STRO-1、CD146、CD105、CD90，不表达血管内皮细胞标志CD45，符合间充质干细胞特征。

3.1 DPSCs外泌体的特征

本研究经超速离心法结合超滤法于DPSCs上清液获得的提取物，符合国际细胞外囊泡学会2014年指导性声明中的外泌体特征[9]。

对于外泌体粒径分布，本研究通过纳米粒子跟踪分析法显示DPSCs上清液提取物直径峰值为144 nm。2015年，Pivoraite 等[10]采用动态激光散射技术对脱落乳牙DPSCs外泌体的直径观察发现，其直径在30～70 nm范围内。Xian等[6]采用纳米粒子跟踪分析法对DPSCs外泌体的粒径分布检测结果为87～143 nm，与本研究结果相近。外泌体尺寸间的差异可能与其来源的细胞以及观察方法不同有关。Sokolova 等[11]通过对人胚肾细胞293T、内皮克隆形成细胞、间充质干细胞三种不同类型的细胞的外泌体分别采用纳米粒子分析技术和动态激光散射技术分析粒径分布，结果发现采用相同技术分析不同细胞的外泌体直径之间存在差异；对同一种细胞来源的外泌体采用不同方法分析其粒径分布，结果也不同，本研究采用的是纳米粒子跟踪分析技术，它是分析颗粒在溶液中动态运动过程的流体动力学直径，粒径较大的颗粒会对检测结果产生较大的影响，会造成粒径结果略偏大。

3.2 SCAP对外泌体的摄取作用

本研究观察到将DPSCs外泌体与SCAP在37 ℃共培养6 h后SCAP能够摄取DPSCs外泌体，而在4 ℃培养条件下SCAP则没有摄取外泌体。虽然4 ℃培养条件下DPSCs处于较低代谢状态，但低温抑制该摄取提示SCAP对DPSCs的摄取是一个主动的过程，而非外泌体随机扩散进入SCAP。2012年，Tian等[12]采用实时荧光显微镜对PC12细胞对十八烷基罗丹明B氯化物(R18，一种亲脂性阳离子染料，可以作为膜探针标记胞吞过程)标记的外泌体的摄取作用进行了观察，发现PC12细胞对外泌体的摄取作用依赖胞吞途径，而胞吞过程具有温度依赖性，采用低温孵育细胞的方法能够抑制温度依赖的胞吞途径[13]。2016年，Kusuma 等[14]发现在4 ℃条件下，人血管内皮细胞对于外泌体的摄取作用下降80%。Huang 等[5]采用37 ℃和4 ℃两种条件下将DPSCs和骨髓间充质干细胞与DPSCs外泌体进行共培养，结果发现4 ℃条件下，两者对DPSCs外泌体的摄取能力明显下降，与本研究的结果一致。

3.3 SCAP摄取外泌体的介导途径

本研究发现采用胞吞抑制剂CPZ、Genistein、LY294002处理SCAP后，SCAP对DPSCs外泌体的摄取能力有明显下降。细胞胞吞途径主要有以下4种，网格蛋白介导的胞吞途径、小窝蛋白介导的胞吞途径、巨胞饮作用和吞噬作用，其中吞噬作用主要是一些具有特殊功能的细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞才会表达的生物学行为，因此本研究主要采用CPZ、Genistein、LY294002三种胞吞抑制剂抑制上述除吞噬作用外的三条胞吞途径，研究SCAP摄取DPSCs外泌体的介导途径。本研究选取的CPZ(10 μmol/L)、Genistein(200 μmol/L)、LY294002(50 μmol/L)经过Tian等[12]采用钙黄绿素细胞活性分析法检测发现三者对细胞活性无明显影响。2014年，Tian等[15]对PC12细胞摄取外泌体的机制的研究发现网格蛋白介导的胞吞途径和巨胞饮作用在PC12细胞摄取外泌体的过程中有重要作用，但该过程不依赖小窝蛋白依赖的胞吞途径。2016年Huang等[5]经体外研究发现，DPSCs对DPSCs外泌体的摄取依赖小窝蛋白介导的胞吞途径，而不依赖网格蛋白介导的胞吞途径。上述研究与本研究的结果不完全一致，这可能与不同的细胞对外泌体的摄取机制不同有关。2018年，Horibe 等[16]对人非小细胞肺癌细胞系(A549)、人结肠癌细胞(HCT116、COLO205)等细胞对同为A549细胞来源的外泌体的吞噬过程的研究发现，抑制胞吞途径可以抑制细胞对外泌体的摄取作用，且COLO205细胞吞噬外泌体同时依赖网格蛋白介导的胞吞途径和小窝蛋白依赖的胞吞途径，HCT116细胞则仅依赖网格蛋白介导的胞吞途径，而A549不依赖上述两条途径，提示即使外泌体来源相同，不同细胞摄取外泌体时依赖的胞吞途径也可能存在差异。

综上所述，本研究发现SCAP能够摄取DPSCs外泌体，低温环境可影响该摄取过程，SCAP摄取外泌体主要依赖网格蛋白介导的胞吞途径、小窝蛋白依赖的胞吞途径和巨胞饮途径，为进一步研究DPSCs外泌体对SCAP的作用提供了实验依据。