通过钻孔加速建立体外椎体骨质疏松模型*

冯庆裕, 谢文伟, 王志坤, 钟欢, 张家勋

1广东医科大学研究生学院(广东湛江 524000)； 2东莞市第三人民医院骨外科(广东东莞 523290)

随着人口老龄化的日趋严重，老年人相关疾病患病率也逐年增长，而老年性骨质疏松症(senile osteoporosis,SOP)是最为常见的老年人疾病之一。据预计，2020年中国人SOP患病人数将达到2.866亿人[1]，而SOP是椎体压缩性骨折发生的高危因素。为了研究骨质疏松性椎体压缩性骨折的发生机制以及相关治疗方式，椎体骨质疏松模型的建立具有重要的临床意义，目前的模型建立方法大体可分为在体模型及离体模型两大类型[2]，在体模型的建立方法大致可分为：手术建模法[3]、药物建模法、基因工程建模法等，但由于建模时间较长，动物个体差异水平大以及实验费用昂贵等缺点限制了模型的大量建立。离体模型则多使用试剂使骨骼脱去钙质，其建模费用相对低廉，建模用时较短等优点而受到临床研究者的喜爱。而二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)可螯合多种金属离子，包括钙离子，其不破坏细胞等微观结构的优点使其成为主流的脱钙液，但其脱钙效果仍比较缓慢。我们在2019年7月4日至9月5日通过对椎体进行不同数量的钻孔，并对其脱钙以及进行生物力学试验，本文将探讨不同数量的钻孔及脱钙来加速建立椎体骨质疏松模型，并比较各组的生物力学实验结果，从而找到一种既能加速脱钙又不影响其生物力学改变的建模方法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂 实验材料：模型取自20只年龄6～8年的雌性陕南白山羊胸腰段椎体(体重25～27 kg)，取其腰椎L1、L2、L3、L4、L5椎体共100个。

实验仪器：双能X线吸收骨密度仪(Hologic Discovery Wi, Hologic Inc, Bedford MA, USA)、数字化X线照片机(DR)、岛津力学实验仪、Stryker 电钻、2 mm 钻头、自制倾斜角度为 15°的不锈钢压缩模具、游标卡尺(型号：0～150，上海量具，测量范围：0～150 mm，读数值：0.02 mm)、量筒、天平、pH 试纸等。

实验试剂：EDTA-2Na(分子量336.21，广州伟达化工有限公司)、NaOH(氢氧化钠，分子量 40，广州伟达化工有限公司)、10%甲醛溶液(10%中性缓冲甲醛溶液，浙江省金华市同和生物科技有限公司)、蒸馏水(25 kg/桶，东莞市仟净环保设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂准备 EDTA-Na2脱钙液：配制方法为称取EDTA-Na2 165 g，NaOH 20 g 加入800 mL蒸馏水，然后剧烈搅拌液体至粉剂完全溶解后定容至1 000 mL，用pH试纸检测其值≈7.0，浓度为 0.491 6 mmol/L。用此法大量复制脱钙液备用。

1.2.2 椎体脱钙前准备 取同一天宰杀20只年龄6～8年的雌性陕南白山羊(体重25～27 kg)的脊柱，将L1、L2、L3、L4、L5椎体从脊柱中分离出来，呈单椎体状，经过肉眼与 DR 观察，无明显骨缺损，病变与畸形，去除椎旁肌肉与椎体表面的骨膜，切断横突保留3 mm，棘突保留2 cm、切除椎间盘，清水冲洗干净。置于10%甲醛溶液中固定24 h。

1.2.3 实验分组 将100个椎体随机分为5组：A组、B组、C组、D组、E组(每组20个)，并在每个椎体做好标记。5组椎体均使用双能X线吸收骨密度仪测定骨密度，并记录数据。

A组：20个椎体不做钻孔处理。B组：椎体使用Stryker 2 mm 钻头的电钻对椎体进行钻20个孔。要求钻孔前先在两侧终板规划好进孔点，钻头予游标卡尺限深，打孔深度为10 mm，但以不钻穿对侧终板为准。钻头垂直于终板表面，孔洞在终板上平均分布，双侧终板钻孔均等交错分布。C组：椎体使用Stryker 2 mm 钻头的电钻对椎体进行钻20个孔。要求钻孔前先在两侧终板规划好进孔点，钻头予游标卡尺限深，打孔深度为10 mm，但以不钻穿对侧终板为准。钻头垂直于终板表面，孔洞在终板上平均分布，双侧终板钻孔均等交错分布。D组：椎体使用Stryker 2 mm 钻头的电钻对椎体进行钻30个孔。要求钻孔前先在两侧终板规划好进孔点，钻头予游标卡尺限深，打孔深度为10 mm，但以不钻穿对侧终板为准。钻头垂直于终板表面，孔洞在终板上平均分布，双侧终板钻孔均等交错分布。E组：椎体使用Stryker 2 mm 钻头的电钻对椎体进行钻40个孔。要求钻孔前先在两侧终板规划好进孔点，钻头予游标卡尺限深，打孔深度为40 mm，但以不钻穿对侧终板为准。钻头垂直于终板表面，孔洞在终板上平均分布，双侧终板钻孔均等交错分布。

1.2.4 对钻孔各组椎体进行生物力学测定 取各组的10个模型分别放置于两模具中间，以1 mm/min的加载速度进行预压，直到100 N 时停止加压，目的为消除蠕变运动以及充分固定，然后将试验力调零；采用2 mm/min的负荷加载速度进行压缩，试验力精确度为 0.01 N，位移精确度为 0.05 mm，加压至有椎体出现骨折时停止，记录出现骨折时候的试验力大小及发生骨折的椎体的高度改变，力学实验过程保持室温恒定并使用空针抽取生理盐水不断于单元椎上喷洒以保持湿润，减少误差；

1.2.5 脱钙 将A、B、C、D、E五组50个椎体浸泡于配制好的EDTA-Na2脱钙液中，每24 h更换脱钙液，每隔5 d使用双能X线吸收骨密度仪测定骨密度并记录数据，记录每组椎体骨密度达到下降超过原骨密度25%的时间。

1.2.6 对浸泡后各组椎体生物力学测定 将各组浸泡完成后的每个模型分别放置于两模具中间，以1 mm/min 的加载速度进行预压，直到100 N 时停止加压，目的为消除蠕变运动以及充分固定，然后将试验力调零；采用2 mm/min的负荷加载速度进行压缩，试验力精确度为 0.01 N，位移精确度为 0.05 mm，加压至有椎体出现压缩性骨折停止，记录出现压缩性骨折时候的试验力大小及发生骨折的椎体的高度改变，力学实验过程保持室温恒定并使用空针抽取生理盐水不断于单元椎上喷洒以保持湿润，减少误差。

2 结果

2.1 各组未浸泡前椎体生物力学结果 对A、B、C、D、E五组进行组间比较，发现5组间的抵抗极限强度及刚度的差异有统计学意义(P<0.001)，通过两两对比可知，A、B、C三组相互间的差异无统计学意义(P>0.05)，D、E两组间的差异无统计学意义(P>0.05)，而D组与A、B、C三组间的差异有统计学意义(P<0.001)，E组与A、B、C三组间的差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。由此可认为在本实验条件下，B、C两组虽然经受钻孔但没明显影响其椎体的抵抗极限强度及刚度，然而钻孔数量上升到一定程度后，D、E两组会降低椎体的抵抗极限强度及刚度见表1。说明钻孔数≤20个以内对椎体生物力学性能影响不大。

2.2 椎体骨质疏松建模结果 建模时间见图1。(1)A组10个椎体单元脱钙前骨密度(BMD)为(1.237±0.030) g/cm3，脱钙45 d BMD达到下降25%以上，BMD为(0.921±0.021) g/cm3。(2)B组10个椎体单元脱钙前BMD为(1.229±0.011) g/cm3，脱钙35 d BMD达到下降25%以上，BMD为(0.916±0.013) g/cm3。(3)C组10个椎体单元脱钙前BMD为(1.229±0.012) g/cm3，脱钙30 d BMD达到下降25%以上，BMD为(0.922±0.022) g/cm3。(4)D组10个椎体单元脱钙前BMD为(1.232±0.023) g/cm3，脱钙25 d BMD达到下降25%以上，BMD为(0.918±0.023) g/cm3。(5)E组10个椎体单元脱钙前BMD为(1.230±0.021) g/cm3，脱钙25 d BMD达到下降25%以上，BMD为(0.915±0.019) g/cm3。

图1 各组椎体建模所需时间

对A、B、C、D、E五组进行组间比较，发现5组间的脱钙前BMD的差异无统计学意义(P>0.05)，脱钙后5组BMD的差异无统计学意义(P>0.05)，由此可认为各组在脱钙前的BMD没有差异，脱钙后的BMD也没有差异。脱钙后椎体达到统一骨质疏松标准，其钻孔数与所需建模时间呈负相关性。见图2。

A：不钻孔椎体脱钙前；B：脱钙15 d；C:脱钙30 d；D:脱钙45 d

2.3 各组骨质疏松椎体生物力学结果 A、B、C、D、E组生物力学试验结果见表2，B组因有1个椎体在行力学试验时发生棘突爆裂排除在外。

项目样本量(个)抵抗极限强度(N)刚度(N/mm)A组104234±36627±8B组94222±54623±9C组104027±42526±9D组103812±28430±10E组103454±76337±1F值4241334P值<0.001<0.001

以A组为标准进行两两对比，发现A、B两组相互间的差异无统计学意义(P>0.05)，而C、 A两组间的差异有统计学意义(P<0.01),D、A两组间的差异有统计学意义(P<0.01)，E、A两组间的差异有统计学意义(P<0.001)，由此可认为本实验条件下，C、D、E组的钻孔数量会降低脱钙后椎体的抵抗极限强度及刚度。说明脱钙后椎体钻孔数≥20个则会影响其生物力学特性。

3 讨论

骨质疏松是导致椎体压缩性骨折的主要因素之一，国内外对骨质疏松性压缩性骨折的发生机制以及治疗进行了大量的研究，而建立椎体骨质疏松模型是研究骨质疏松椎体压缩性骨折的重要基础。

动物骨质疏松模型可分为在体模型和离体模型两大类[4]，在体模型又可根据建立方法大致可分为：手术建模法、药物建模法、基因工程建模法[5-7]等。其中手术建模法在实验中最为常用，而手术建模法可通过切除动物卵巢、睾丸、甲状旁腺等方式，其中以切除卵巢去势法为主流方法。

建立在体模型的动物常用的有鼠类[8]、狗、猪、羊以及灵长类动物等。其中大型动物常用雌性绵羊或山羊进行去势法来建立，但存在明显的缺点，其建模时间长达12个月以上[9]、而且需要控制的变量多，如受到个体差异、季节、气候、喂食的方法及山羊的健康状况等，建立的模型往往差异较大，较难满足大量实验的要求。因而寻求一种快速、有效的骨质疏松模型显得具有其必要性。

而动物体外模型满足了这个需要，动物离体模型有着建模时间较短[10]、可大量制备、不涉及道德伦理问题等优点，体外模型通过使用盐酸、EDTA-2Na等试剂来制备，这一过程被称为去矿化[11]，还有学者尝试用硝酸、双氧水等试剂对骨骼进行脱钙。盐酸是最早使用来脱钙的试剂，Akbay等[12]使用盐酸在25 h内成功建立小牛腰椎骨质疏松模型，张树芳等[13]通过使用盐酸对小牛腰椎进行脱钙，成功建立起椎体骨质疏松模型，但使用盐酸所制作的动物椎体骨质疏松模型与人体内的骨质疏松病理过程不同，该方法建立的模型更接近于骨软化，而且盐酸会使得骨骼内的蛋白等物质变性，并非最佳的脱钙试剂。双氧水是一种强氧化剂，在外科常用于清创消毒，其能破坏骨骼中有机成分，改变骨骼的生物力学性能，张智海等[14]曾用双氧水浸泡山羊椎体，发现该方法虽然可以降低椎体的弹性模量，但由于其并无脱钙作用，因此不常用于建立骨质疏松模型。而EDTA-2Na是一种金属螯合剂，能有效鳌合骨骼中的钙离子[15]，其脱钙作用对骨骼中有机成分，如细胞等微观结构破坏较少，在进行脱钙后也能进行免疫组化的研究[16]，但其存在着脱钙的速度较慢的缺点。

本实验使用的成年雌性陕南白山羊的腰椎作为研究对象，国际公认山羊是制备骨质疏松模型的常用大型动物之一[17]，蒙文丹等[18]认为羊是一种相当有研究价值的骨质疏松模型建模实验动物，其成年动物骨密度略大于我国成年人的椎体BMD，可通过脱钙使其BMD下降，从而模拟不同程度的椎体骨质疏松模型，本实验用骨量丢失百分率诊断法[19]来判断椎体是否达到骨质疏松的诊断标准。

本研究对建模方法进行改造，对实验椎体进行不同数量钻孔，使得脱钙液能直接与椎体内的松质骨直接接触，加大接触面积，从而加速椎体骨质疏松模型的建立。但由于钻孔的数量以及程度会对椎体的结构发生一定程度的破坏，因此本实验钻孔方式设计定义为只在椎体双侧终板表面垂直钻孔，并使钻孔数交错分布均匀，目的在于当进行垂直受压生物力学测定时，孔洞方向与测定压力方向一致，相对于其他侧面钻孔，更能消除因钻孔导致对椎体抗压力的外来因素的干扰。

本实验目的是试图寻求到一种既不影响椎体生物力学性能、保证达到骨质疏松标准的基础上，又能促进加速脱钙过程加快制备出椎体骨质疏松模型的方法。从而更好地为骨质疏松研究提供良好服务，又不至于影响椎体生物力学结果的方法来快速制备椎体骨质疏松模型。

由本实验拟结果可知，椎体脱钙前经过不同钻孔数后，进行生物力学测定，发现钻孔数≤20个以内对椎体生物力学性能影响无统计学意义。在椎体脱钙建立成一定标准的骨质疏松模型时，发现其钻孔数与所需建模时间呈负相关性，并且当钻孔数≥20个则会影响其生物力学特性有统计学意义。

综上分析得出以下结论：(1)对无论脱钙前还是脱钙后的椎体进行垂直终板钻孔达到一定数量后均会对其生物力学指标产生明显影响。(2)当在对椎体进行约10个数量的钻孔时，既可满足达到骨质疏松标准建模的条件，又不影响其所需的生物力学特性。(3)经过10个数量的钻孔时，能可在35 d内建立出椎体骨质疏松模型，相比传统不钻孔建模所需的45 d，明显缩短时间，从而达到了在尽量不影响椎体极限抵抗强度与刚度的前提下，而达到快速建模的本研究目标。

本建模方法尽管不能完全替代使用去势法建立的雌性山羊椎体骨质疏松在体模型，但可以在某种程度上为骨质疏松椎体生物力学研究快速有效地提供椎体骨质疏松模型数据，从而可以为在体模型甚至人体实验作基础研究。本研究尚存在一些不足：(1)本研究通过钻孔的方式加速制备时间，不免会对椎体结构存在破坏；(2)本研究的样本数量不多，需加大样本数量以进一步验证钻孔数量与建模时间以及对生物力学特性的影响。下一步，本团队将研究使用不同填充物填充骨质疏松椎体压缩性骨折模型术后的生物力学研究。