选择性剪接在卵巢癌中的研究进展

徐 蕾，黄骁昊，张智弘，戴辉华

卵巢癌是一组异质性的恶性肿瘤，不同亚型在病因、分子生物学和许多其他特征上均有所不同，是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，病死率高居妇科肿瘤之首[1]。全球每年约有239 000例新发病例(占所有癌症的3.6%)和152 000例死亡病例(占所有癌症死亡人数的4.3%)[2]。2015年中国肿瘤数据显示，约有52 100个新发卵巢癌病例以及约有22 500人死于该疾病[3]。由于卵巢癌早期症状不明显以及缺乏有效的筛查手段，约70%的患者一经诊断已是晚期，许多患者通常是在腹腔多发转移发生很久之后才出现症状。越来越多的证据表明，许多与癌症发生、发展相关的基因会发生剪接异常，从而产生致癌或抑癌蛋白。目前卵巢癌中已经有许多异常的选择性剪接被发现，理解这些异常剪接发生的分子机制有可能为卵巢癌的治疗提供新线索。

1 选择性剪接

RNA剪接主要发生在细胞核的剪接体，是将不成熟的mRNA前体中的内含子去除并将外显子连接在一起生成成熟的mRNA，其过程依赖于顺式作用元件和反式调节因子调控[4]。RNA剪接的核心 — 剪接体，是由蛋白质和核内小RNA(snRNA)组成的大分子复合物，在mRNA前体的外显子-内含子边界的特定序列上组装，并定义3′和5′的剪接位点(SSs)和分支点的位点(BPS)，其结构在整个剪接反应过程中经历动态重塑。除核心剪接体外，还有调控蛋白参与调控剪接反应，并通过与外显子或内含子的增强子或沉默子元件结合起剪接激活因子或抑制因子的作用[4]。

剪接过程中主要由剪接位点介导外显子的识别，辅助性剪接因子可以推动剪接体对剪接位点的识别决定留下还是切除某些外显子，因此剪接过程是多变的，这就是选择性剪接发生的机制。选择性剪接是促进转录组和蛋白质组多样性的重要机制之一，约95%的具有外显子的人类基因存在选择性剪接[5]。选择性剪接的类型并不单一，主要有五种类型：外显子跳跃式(也称为盒外显子)、互斥外显子、选择性5′或3′剪接位点和内含子保留。

选择性剪接不仅在正常的生理过程(包括造血、大脑发育、肌肉功能)，甚至在许多疾病(如肿瘤)中均是重要的发生机制之一。越来越多的研究结果表明，选择性剪接参与了肿瘤的增殖、凋亡、缺氧、血管生成、免疫逃逸和转移等过程。更重要的是，肿瘤微环境在一定数量剪接因子的作用下会发生特异性的选择性剪接改变[6]，剪接因子表达的改变可能导致肿瘤选择性剪接信号的整体改变[7-8]；在某些情况下，剪接因子的突变可产生一种特定的促癌剪接亚型[9]。因此，选择性剪接为许多生物过程提供了一个关键且灵活的调控层面，而对选择性剪接的深入研究，可能会为肿瘤提供潜在的诊断和治疗的生物标志物[10]。选择性剪接事件在胶质母细胞瘤、乳腺癌和肺癌患者中的预后价值已被报道[11-13]。目前已经有一些研究通过比较正常卵巢组织和癌组织的方法提出了卵巢癌中一些特异性选择性剪接事件，但尚未有对卵巢癌中选择性剪接事件的系统性回顾，该文就卵巢癌的选择性剪接进行具体的阐述，并评估选择性剪接在卵巢癌中的预后、诊断及治疗的潜力。

2 卵巢癌中的选择性剪接事件

2.1 选择性剪接在卵巢癌血管生成中的作用L1CAM又称CD171或L1，是由L1CAM基因编码的细胞黏附分子。其是一种细胞表面糖蛋白，其胞外部分包括6个类胰岛素样结构域、5个纤维连接蛋白Ⅲ型重复序列、一个短跨膜结构域和一个保守的胞质尾区。L1CAM最初是在神经系统中发现的，并因其在神经发育和可塑性方面的重要功能而被描述。进一步研究表明，L1CAM的表达并不局限于神经系统，其在卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺导管腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤等几种不同肿瘤的血管系统中也均有表达，而在正常血管中没有或只有非常低的表达[14]。L1CAM在肿瘤相关血管内具有不同的内皮细胞功能，如通透性、周细胞覆盖率和极性，由于这些细胞过程影响肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移，L1CAM已成为肿瘤血管特异性治疗的潜在靶点。L1CAM主要有两种可变剪接亚型：神经元通常表达L1CAM的全长亚型，而非神经元细胞则产生缺乏外显子2和27的较短亚型。外显子2可以与其他神经元蛋白相互作用，而外显子27促进L1CAM的内吞作用[15]。

神经肿瘤腹侧抗原2(neuro-oncological ventral antigen 2, NOVA2)是血管发育过程中选择性剪接的重要调节因子[16]。NOVA2最初在神经细胞中被识别，其通过与其靶标pre-mRNA内的YCAY(Y=C/U)重复簇结合来控制多个参与神经发育过程的基因的选择性剪接。NOVA2也在血管内皮中表达，并在血管生成过程中受到调控[16]。NOVA2在转录后水平控制内皮细胞极性的建立，这一过程对血管腔的形成至关重要，因此对血管生成也至关重要[17]，相应地，NOVA2缺失会造成体内血管形成的缺陷。而在卵巢癌血管中，NOVA2的表达明显上调，且NOVA2的表达仅在卵巢癌的血管内皮中检测到，特别是在内皮细胞胞核中。通过对卵巢癌的生存曲线分析发现，与低表达NOVA2的患者相比，高表达NOVA2的患者具有较短的生存期[18]。

Angiolini等[18]通过研究发现L1CAM外显子25跳跃会产生一种在细胞外基质释放的新的可溶性蛋白质亚型L1-ΔTM，其具有显著诱导新生血管生成的作用。值得注意的是，在肿瘤血管中NOVA2水平的升高常常伴随着L1-ΔTM的表达升高，而且过表达NOVA2会促进L1CAM外显子25的跳跃。也就是说，NOVA2可促进卵巢癌血管中L1CAM pre-mRNA的选择性剪接，这也就解释了L1-ΔTM在肿瘤血管中高表达的原因，这些证据表明NOVA2是卵巢癌新生血管形成的潜在驱动因素。事实上，干扰细胞表面L1CAM的功能，同时干扰细胞外L1-ΔTM的功能，可能会有效抑制肿瘤血管生成，为卵巢癌的治疗提供新方向。

2.2 选择性剪接在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用CTNNBL1是一种广泛表达的核蛋白，与剪接体的Prp19复合物结合，并与其组成部分CDC5L相互作用[19]。Prp19是一种在剪接体的催化激活过程中起作用的复合物。Li等[20]揭示CTNNBL1在高级别浆液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer, HGSOC)组织和卵巢癌细胞系中过表达，且在HGSOC患者中，CTNNBL1的高表达与预后不良相关。

全基因组转录组分析显示，CTNNBL1在卵巢癌细胞中调控多种剪接事件和基因表达，其中干扰素γ诱导蛋白16(interferon-inducible protein 16, IFI16)在HGSOC中显著下调。Western blot分析表明无论在CTNNBL1过表达还是敲低的卵巢癌细胞中，CTNNBL1都负调控IFI16的表达，而过表达的IFI16可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。通过在A2780细胞中过表达CTNNBL1，发现IFI16的剪接亚型显著减少。综上所述，IFI16与卵巢癌细胞功能相关，而CTNNBL1调控IFI16的表达和选择性剪接。

FOXM1是FOX家族基因成员之一，是一种与细胞增殖相关的转录因子。由于外显子Va和Ⅶa的选择性剪接，FOXM1蛋白共有3种亚型，其中FOXM1B和FOXM1C起转录激活作用，而FOXM1A无转录活性[21]。Li等[20]发现在HO8910卵巢癌细胞中敲降CTNNBL1后，FOXM1B和FOXM1C的表达下降，而FOXM1A的表达上调。这些结果提示CTNNBL1调节卵巢癌细胞中FOXM1的选择性剪接，从而促进卵巢癌细胞的增殖。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是胚胎发育过程中至关重要的一步，但在癌症复发和转移的过程中被异常激活，EMT促进了癌细胞向远处迁移的能力，而间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)则被认为是癌细胞在远处再定植的必要驱动力。上皮剪接调控因子1(epithelial splicing regulatory protein 1, ESRP1)在正常上皮细胞中表达上调，在侵袭早期表达下调，并会在癌细胞转移和定植的淋巴结中重新表达。Chen等[22]发现ESRP1在上皮性卵巢癌细胞中高表达，且与不良预后相关，并且证实了在肿瘤转移的早期，下调的ESRP1可以诱导EMT，调控CD44 mRNA的选择性剪接，促进CD44v向CD44s转换，以增强上皮性卵巢癌细胞的迁移和侵袭。由于EMT是肿瘤转移进展中的早期步骤，了解ESRP1等剪接因子在调节EMT中的作用可能会提高临床预防卵巢癌进展的能力。

原癌基因受体(proto-oncogene recepteur d'origine nantais, RON)编码巨噬细胞刺激蛋白的跨膜酪氨酸激酶受体(macrophage-stimulating protein, MSP)，在细胞运动、黏附、增殖、凋亡、EMT等多种肿瘤生物学过程中起重要作用[23]。Mayer等[24]通过对45例卵巢癌组织和4例正常卵巢组织研究发现，RON在卵巢癌组织中高表达，而在正常卵巢组织中未检测到表达。除了成熟的RON，目前RON共有6种选择性剪接的亚型。其中，相较于其他RON的剪接亚型，选择性切除外显子11产生的RONΔ165在卵巢癌中更为常见，其次是RONΔ160或RONΔ155(选择性切除外显子5或6)，说明这些亚型可能在卵巢癌发生、进展过程中起着更为重要的作用。因此，RON表达谱的改变可能成为治疗卵巢癌的有利靶点，如化学抑制剂或针对癌症相关RON剪接亚型的特异性抗体有可能为卵巢癌的治疗提供新的思路。

2.3 选择性剪接在卵巢癌细胞凋亡过程中的作用在多细胞生物中，细胞的生长和分化受程序性细胞死亡或凋亡的控制，其中一个主要的凋亡通路是由Fas受体(Fas)-Fas配体(FasL)相互作用触发的。Fas是一种属于肿瘤坏死因子受体超家族成员的跨膜蛋白，其与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。肿瘤细胞常常通过下调Fas来逃避Fas信号，并产生与FasL结合的可溶性Fas蛋白(sFas)，从而阻断细胞凋亡。sFas是Fas pre-mRNA一种选择性剪接产物，通常由切除外显子6(FasΔEx6)编码的跨膜生成序列产生[25]。

剪接因子45(splicing factor 45, SPF45)是剪接体的组成部分，是一种新的剪接因子，作用于内含子去除的第二催化步骤。其通过识别内含子内的近端AGs参与选择性剪接。其也可以识别远端AGs，并可能在剪接中有其他未知的作用[26]。SPF45在大多数组织中低表达，在内含子中识别和激活3′剪接位点的AG。研究发现在哺乳动物细胞中，SPF45调控Fas第6外显子的剪接，并且通过敲除SPF45发现减少了sFas的产生、增加了Fas在细胞表面的积累以及细胞对凋亡的敏感性[25]。SPF45在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中均过表达，其作用可能与增殖、化疗耐药[26]以及细胞迁移和侵袭[27]有关。因此，通过敲除SPF45，有可能促进卵巢癌细胞的凋亡。

2.4 选择性剪接在卵巢癌化疗耐药中的作用目前，卵巢癌的治疗主要采用手术结合静脉化疗的方法，其中化疗不仅可以缩小病灶，并能显著延缓其复发和转移。紫杉醇和铂类是目前用于卵巢癌的临床化疗的主要药物。然而，由于个体体质和对化疗的敏感性不同，不同患者接受相同的化疗方案获得的疗效也可能不同。化疗的治疗潜力受耐药的限制，耐药既可能是先天的，也可能是后天获得的；可能是单药耐药，也可能是多药耐药。

多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)最初是从耐药肺癌细胞系中发现的，是与多药耐药相关的ATP结合盒超家族转运蛋白(ATP binding cassette transporter subfamily, ABCC)的典型成员之一。MRP1在正常组织中广泛表达，可主动转运多种内源性、外源性共轭或非共轭有机阴离子[28]。研究表明，MRP1在肿瘤细胞系中的过表达可通过减少细胞中药物的积累，使其对许多天然产物化疗药物如蒽环类药物、长春花生物碱和表多巴叶毒素产生耐药性。有实验结果表明，MRP1 mRNA在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织，在化疗耐药组中的表达明显高于化疗敏感组[29]。He等[28]通过Ⅲ期或Ⅳ期卵巢癌组织和正常卵巢组织对比，发现卵巢癌中MRP1剪接亚型的平均表达量是正常组织的2倍，同时还发现MRP1剪接亚型的增多与剪接因子PTB和SRp20过表达相关，该研究揭示了卵巢癌中MRP1外显子10和19之间的跳跃事件很可能是PTB的过表达导致的，而SRp20过表达则通过促进对位于内含子内的弱外显子的识别而产生更多的MRP1剪接亚型。然而关于MRP1选择性剪接的具体机制还有待深入研究，能够更好地理解耐药的生物学机制将为治疗干预和个体化治疗提供新的选择。

3 结语

选择性剪接参与肿瘤的发生、发展，与卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、血管生成和耐药密切相关。卵巢癌作为女性生殖系统恶性肿瘤之首，严重危害广大妇女的生命健康，虽然近年来治疗方案不断改进，但患者的5年生存率依然提升缓慢，因此深入了解选择性剪接在卵巢癌进展中扮演的角色及发生机制，有助于从新的角度寻找早期诊断卵巢癌的生物标志物，提供卵巢癌治疗的新靶点，改善患者的耐药及预后，提高卵巢癌患者的生活质量。