母鼠高脂喂养与胎鼠心肌损害的关系

王 尧，覃有振， 彭慧敏， 王慧深，巴宏军

1)广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤中心 广州 510080 2)中山大学附属第一医院心血管医学部心血管儿科 广州 510080

高脂血症与心血管疾病密切相关。研究[1]表明，家族性高胆固醇血症的后代在出生时或儿童早期已开始形成冠状动脉粥样硬化，到青春期已较明显。 已有研究[2]表明，妊娠期妇女普遍存在高脂血症，妊娠期高脂血症可导致胎儿生长发育异常并可持续至儿童期甚至成人期。妊娠期高脂血症与新生儿高血糖及低出生体重等密切相关[3-4]，也可能是先天性心脏病发病的高危因素之一[5]。然而，妊娠期妇女脂代谢异常是否引起子代心肌异常尚不明确。本研究拟通过孕期高脂喂养诱发SD大鼠妊娠期高脂血症，观察妊娠期高脂血症对胎鼠心肌细胞组织结构的影响，探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1动物来源与分组鼠龄96～103 d、体重240～260 g的清洁级SD大鼠30只，雌鼠20只，雄鼠10只, 购于广州市中医药大学动物研究中心[SCXK(粤) 2013-0034]。先置于湿度60%～70%、室温18～25 ℃的环境中予普通饲料行适应性喂养。3 d后雌雄按2∶1比例合笼,次日清晨阴道涂片发现精子为受孕，记为妊娠第0天。孕鼠随机分为两组，每组10只，分别予普通饲料和高脂饲料喂养，妊娠第21天为喂养终点。普通饲料及高脂饲料均购于广东省医学动物实验中心。普通饲料由粗蛋白(20.7%)、粗纤维(38%)、粗灰分(26.6%)、粗脂肪(4.2%)、水分(8.2%)、矿物质(2.3%)组成。高脂饲料由胆固醇(1%)、胆盐(0.2%)、猪油(10%)、蛋黄粉(10%)、普通饲料(78.8%)组成。

1.2标本采集和处理所有大鼠在实验开始前一天下午2：00开始禁食，禁食16 h后尾部采血，3 000 r/min离心10 min，于低温冰箱冻存备查血脂。妊娠第21天再次留取血样；剖宫取胎， 每只母鼠随机选取一只胎鼠，取大小约1 mm×1 mm×1 mm的胎鼠心尖部组织置于多聚甲醛溶液中固定，备行组织学观察。

1.3母鼠血脂检测血脂检测包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)。试剂盒由雅培公司提供。

1.4胎鼠心肌组织学表现取胎鼠心尖部心肌组织，于多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋后切片(厚度5～6 μm)，然后行HE染色。每只胎鼠随机选择3张切片于400倍镜下观察心肌组织病理学改变并计算病变积分[6]。心肌病变包括脂肪颗粒沉积、胞核染色加深、细胞结构模糊等。计分规则：无病变为0 分, 病变范围<25%、25%～50%、51%～75%、>75%分别记为1、2、3、4分。每张切片选取5个视野,计算平均得分。试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.5胎鼠心肌组织中氧化应激指标的检测采用TBA方法检测胎鼠心肌组织中丙二醛(MDA)水平，采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶总活力(T-superoxide dismutase,T-SOD)。试剂盒购买自南京建成生物工程研究所。

1.6胎鼠心肌组织中磷酸化P38(p-P38)、P53蛋白的检测分离胎鼠心尖部心肌组织，用RIPA裂解液裂解，4 ℃高速离心提取组织蛋白,使用BCA 法进行定量,煮沸后行SDS-PAGE分离蛋白(美国Bio-Rad公司,恒压80～110 V,1.5 h)。将蛋白转移至PVDF 膜,用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，分别加入p-P38、P53抗体(均1∶500稀释)、GAPDH 抗体(1∶2 000稀释)4 ℃孵育过夜，洗膜3 次后加入二抗于室温下孵育1 h。抗体均购自美国Abcam 公司。ECL发光液显色(A液和B液按1∶1混合)。利用Image J软件对条带进行灰度分析，以目的条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.7统计学处理采用SPSS 19.0进行数据分析。两组母鼠孕前及孕第21天血脂水平的比较采用重复测量数据的方差分析，两组胎鼠心肌组织中T-SOD活性、MDA水平、p-P38、P53 蛋白表达水平的比较采用两独立样本的t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组大鼠孕前及孕第21天血脂水平的比较见表1。孕前、孕第21天A组母鼠血脂水平差异无统计学意义。B组孕第21天TC、TD、LDL-c较孕前显著升高，HDL-c显著降低。

表1 两组母鼠孕前及孕第21天血脂水平的比较(n=10) mmol/L

2.2两组胎鼠心肌组织学表现光镜下观察，A组胎鼠心肌细胞呈椭圆形,胞核形态规则,位于细胞中央, 呈圆形或椭圆形，核染色均匀,且胞浆丰富(图1A )。B组胎鼠心肌细胞结构不清晰, 可见较多脂肪样颗粒,胞核形态不规则且染色较深(图1B)。A组胎鼠心肌组织病变积分为(0.60±0.11),B组为(1.26±0.65)， B组大于A组(t=3.166，P=0.005)。

左上、左下：A组100倍、400倍；右上、右下：B组100倍、400倍

2.3两组胎鼠心肌组织中T-SOD活性与MDA水平的比较B组胎鼠心肌组织中T-SOD活性及T-SOD/MDA比值较A组降低，MDA水平较A组升高，见表2。

表2 两组胎鼠心肌组织中T-SOD活性及MDA水平的比较

2.4两组胎鼠心肌组织中p-P38、P53蛋白表达的比较见图2及表3。与A组比较，B组胎鼠心肌组织中p-P38、P53 蛋白表达上调。

图2 两组胎鼠心肌组织中p-P38 和P53蛋白的表达

表3 两组胎鼠心肌组织中P53和p-P38蛋白表达的比较

3 讨论

妊娠是女性特殊的生理过程，在妊娠期，机体的组织器官会产生一系列生理功能的变化以适应母体代谢及胎儿生长发育的需要，这其中包括血脂代谢状态的改变。从生理角度讲，孕期一定程度的血脂水平升高是保障胎儿正常发育所必需的，但是如果血脂水平超过一定程度，易导致机体损害，就属于病理现象。既往研究[7-8]发现，妊娠期高脂血症可导致严重的妊娠期并发症，如妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、急性胰腺炎等。康玮等[9]的研究表明，大鼠妊娠期高脂血症可影响子代成年期的血脂代谢并导致肥胖的发生。

本研究结果显示，孕期高脂喂养的母鼠存在严重的脂代谢紊乱，其胎鼠心肌细胞受损，提示孕期高脂血症与胎鼠心肌细胞的损害有关。目前关于高脂血症对心肌细胞损害的机制尚不明确。既往研究[10-11]发现，高脂血症可造成胎盘动脉粥样硬化，并进一步影响胎盘功能，可能与胎盘功能障碍所致遗传物质异常有关，然而具体的机制尚不清楚。也有研究[12]认为，高脂血症易致机体氧化应激损伤，氧化应激水平升高可致机体器官结构及功能损伤。因此，有必要进一步探讨母鼠高脂血症对胎鼠心肌细胞损害的具体分子机制，尤其是与氧化应激的关系。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内氧化与抗氧化作用失衡，体内高活性分子如活性氧自由族和活性氮自由族产生过多,引起炎性细胞的侵入，造成组织损伤[13]。脂代谢异常是机体重要的代谢异常，高脂血症与冠心病、糖尿病、代谢综合征等密切相关，而氧化应激参与了糖尿病、多囊卵巢综合征、神经病变等的发生发展[14-16]。高脂血症是氧化应激的主要诱因之一[12]。本研究结果显示，高脂喂养母鼠的胎鼠心肌组织中T-SOD水平较对照组下降，而MDA水平升高；同时心肌组织中p-P38、P53 蛋白表达较对照组上调。本研究结果提示孕期血脂代谢紊乱的母鼠体内存在较高的氧化应激水平，与文献[17]报道的一致。氧化应激水平升高容易启动细胞凋亡程序，而细胞内氧化应激物质可导致核酸损伤，进一步激活转录因子P53，促进细胞凋亡[18]。因此，高脂血症母鼠其胎鼠心肌损害可能与氧化应激诱发的心肌细胞凋亡有关。

综上所述，母鼠高脂血症会对胎鼠心肌细胞造成一定的损害，并且这种心肌损害可能与氧化应激增强有关。因此，妊娠期合理安排营养及定期监测血脂水平对维持胎儿健康具有十分重要的意义。