可注射羟乙基壳聚糖基水凝胶理化性能及其对人牙髓细胞增殖和成牙本质向分化的作用

曹春玲，杨聪翀，屈小中，韩 冰△，王晓燕△

(1．北京大学口腔医学院·口腔医院，牙体牙髓科 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081； 2．中国科学院大学材料科学与光电技术学院，北京 100049)

近年来，牙髓再生成为口腔牙髓病学研究的热点议题之一。牙髓干细胞(human dental pulp cells，hDPCs)是牙髓组织中易得的一类成体干细胞[1]，在不同因子和微环境的调控下可发挥其多分化潜能，是牙体组织损伤再生修复能力的重要影响因素[2-5]。牙髓再生组织工程除了需要干细胞、支架材料、生长因子的共同作用，还需要支架材料具有可操作性，便于置入狭长细小的根管空腔中。近来，水凝胶作为组织工程支架用于牙髓再生得到众多学者的关注[6-9]。水凝胶是一种极为亲水的三维网络结构[9]，其三维网络结构和黏弹性与生物体内由生物大分子构成的细胞外基质极为类似，具有良好的生物相容性，可以较好地模拟细胞生活的微环境。水凝胶可制备为可注射剂型，可注射水凝胶在根管内原位形成网络结构后[8, 10]，可以三维包封细胞[11-12]。

壳聚糖(chitosan, CS)是天然多糖，此类生物材料的临床试验研究表明，将其植入、注射、局部应用或摄入动物体内后未见任何过敏或炎性反应，具有良好的生物相容性，同时又对细菌、真菌、寄生虫有一定的毒性，可发挥天然抑菌作用[13]。羟乙基壳聚糖(glycol-chitosan, GC)是壳聚糖的衍生物，其水溶性得到了提高，便于水凝胶的制备。GC与端苯甲醛基修饰的聚乙二醇(OHC-PEO-CHO)通过席夫(Schiff)反应可发生溶胶-凝胶转化，形成柔软的水凝胶网络，但GC水凝胶机械强度较低，难以作为组织工程支架提供足够的力学支持。因此，本课题组在以GC-OHC-PEO-CHO为水凝胶主网络的基础上穿插了海藻酸钠(alginate, Alg)-氯化钙(CaCl2)次网络，制备出GC基双网络水凝胶，其力学性能获得提升[8]。

水凝胶的力学性能除与其网络结构有关外，也与其组成成分的浓度配比有关。随着组分浓度的提高，水凝胶的力学性能增强[11]。不同力学性能的水凝胶模拟的细胞外基质硬度不同，影响着其中细胞的生物学行为。本研究旨在通过构建GC基单/双网络水凝胶和hDPCs的细胞支架系统，探索不同组成配比的GC基单/双网络水凝胶及其理化性能对hDPCs增殖与分化的作用，为探索更适合根管内牙髓再生的材料提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备

羟乙基壳聚糖(GC)和海藻酸钠(Alg)购自美国Sigma-Aldrich公司；苯甲醛修饰的聚乙二醇(OHC-PEO-CHO)由中国科学院化学研究所合成； DMEM培养基、胰蛋白酶、100 U/mL青霉素、100 g/L链霉素、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)购自美国Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国ScienCell公司和天津康源公司；细胞增殖/毒性检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)购自日本同仁化学研究所；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；SYBR Green酶购自瑞士Roche公司；Von Kossa染色试剂盒购自北京Solarbio公司。

实验所用设备：万能力学实验机购自美国Instron公司；精密电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus公司；倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜购自美国Leica公司；酶标仪(ELx800)购自美国BioTek公司；超微量分光光度计(NanoDrop 2000)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；梯度PCR仪(EPS 5345)购自德国Eppendorf公司；real-time RT-PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 羟乙基壳聚糖基单/双网络水凝胶的制备

配制质量分数为羟乙基壳聚糖6%(或3%)，氯化钙 2%(或1%)，海藻酸钠6%(或3%)，OHC-PEO-CHO 2%(或1%)的溶液(表1)，将各组分溶液在孔板中轻柔搅拌混合均匀，通过席夫反应和静电相互作用实现在生理环境条件(pH=7.4, 37 ℃)的双网络凝胶化(下文缩写为DN3131和DN6262)。

表1 分组及组分浓度Table 1 Component concentration of each group

配制质量分数为羟乙基壳聚糖3%的溶液和OHC-PEO-CHO 1%的溶液，通过席夫反应动态交联实现在生理环境条件(pH=7.4, 37 ℃)的单网络凝胶化 (下文缩写为GC31)。模式图见图1。

1.3 水凝胶的降解性评价

将水凝胶完全浸置于DMEM培养液内，37 ℃条件下放置，每3天更换新的培养液，分别于第0天、第7天、第14天、第21天称重：将水凝胶表面的液体用吸水纸轻轻擦干，在精密电子天平上称重。计算重量减少的百分比。

1.4 水凝胶的可注射性研究

根管模型注射实验：选择NISSIN透明S1单根管模型，使用Protaper Sx-F3序列预备，使用手用锉将根管根尖区预备至70#。使用双联注射器进行模拟根管内注射。

体外注射时间测定：恒力15 N施以双联注射器，记录不同组成配比的水凝胶推出0.5 mL体积所需的时间。针头型号为21G。

1.5 水凝胶的力学性能检测

制备不同浓度配比的GC基单/双网络水凝胶，通过双联混药器混合注入直径为10 mm的圆柱形模具，30 min后得到凝胶，脱模得到直径为10 mm, 高度为10 mm的圆柱体，使用万能试验机测定其断裂应力，测试条件：载荷100 N，加载速度1 mm/min。

1.6 GC基单/双网络水凝胶包封hDPCs三维培养的体外生物学研究

按照1.4所示步骤及比例制备GC31、DN3131和DN6262，预先将细胞消化为悬液，与各组分溶液在孔板中搅拌混合均匀，分别形成3组细胞终浓度为1×106/mL的GC基单/双网络水凝胶。

1.6.1GC基单/双网络水凝胶培养hDPCs的增殖能力检测

hDPCs分别于培养的第1、4、7、10、14天，使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力。Calcein-AM/PI活死细胞染色法分别对第1、7、14天各组三维培养的细胞染色，倒置荧光显微镜下观察细胞数量和状态，其中绿染为活细胞，红染为死细胞。

1.6.2矿化诱导液培养条件下，GC基单/双网络水凝胶培养hDPCs的分化能力检测

矿化诱导液(含50 mg/L抗坏血酸、5 mmol/L β-磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松)浸泡各组水凝胶，体外三维培养14 d后分别检测成牙本质向分化标志物及矿化相关因子的表达情况和矿化结节的形成。每3天更换新的培养液。

1.6.2.1实时荧光定量PCR测定 利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，实时荧光定量PCR法检测DMP-1、DSPP、ALP表达，相关引物序列见表2。数据分析采用2-ΔΔCt法，以β-actin为内参照，实验重复3次。

1.6.2.2组织学染色 将体外培养14 d细胞/水凝胶三维支架用PBS冲洗后，固定于4%(体积分数)多聚甲醛中，乙醇序列脱水，制备石蜡切片，厚度为5 μm;然后切片脱腊、水化，进行Von Kossa染色。

表2 引物序列Table 2 The chain of reaction primers

DSPP, dentin sialophosphoprotein; DMP-1, dentin matrix protein-1; ALP, alkaline phosphatase.

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0进行统计分析,可注射性能、降解率、CCK-8测定、real-time RT-PCR结果均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用SNK法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶的可注射性能

GC31、DN3131、DN6262在生理条件下(37 ℃, pH=7.4)均可完成溶胶-凝胶转变，GC31的凝胶时间约为200 s，DN3131、DN6262的凝胶时间约为30～50 s，其大体观如图2。3组水凝胶都可通过21G针头顺畅推出注入根管模型内达根管全长，其典型过程见图3。向根管内推注相同体积水凝胶，GC31组的推注时间最短，DN3131次之，DN6262推注时间较DN3131长(P<0.05，图4)。

2.2 水凝胶的断裂应力

GC31单网络水凝胶的断裂应力为1.10 kPa，双网络水凝胶的断裂应力高于单网络水凝胶(P<0.05)， DN3131的断裂应力为7.33 kPa，DN6262的断裂应力明显升高，可达43.30 kPa(图5)。

2.3 水凝胶的降解性能

GC31水凝胶的体外降解速度最快(P<0.05)，1周后，GC31组的剩余质量百分比已不足60%，3周后，GC31组的剩余质量百分比已不足20%(图6A)。双网络水凝胶降解速率较单网络水凝胶明显更慢，剩余质量百分比仍可维持在70%～90%。DN3131组与DN6262组的降解率差异无统计学意义(P>0.05)， 3周后双网络水凝胶大致保持原有形态(图6B)。

2.4 hDPCs在水凝胶中的增殖能力

在各组水凝胶中，细胞均成球形生长，分布较均匀。CCK-8法检测(图7A)发现3组hDPCs均持续增殖，GC31单网络水凝胶组中的细胞较双网络水凝胶组的增殖能力高，细胞数量多(P<0.05)。双网络水凝胶组中， DN3131组的hDPCs较DN6262组中的增殖能力高，细胞数量多(P<0.05)。Calcein-AM/PI双染细胞结果显示(图7B)，活细胞量均随着培养时间的延长而增加，其中GC31组较双网络水凝胶组中的活细胞数量多，且部分细胞聚集以细胞团的形式存在。

2.5 hDPCs在水凝胶中的分化能力

诱导培养的第14天，DN3131、DN6262中DMP-1和 ALP相对表达量较GC31组高(P<0.05)。DN3131组中DSPP相对表达量也高于GC组(P<0.05)，但DN6262组中DSPP相对表达量与GC31组差异无统计学意义(P>0.05，图8)。

Von Kossa染色(图9)结果显示，矿化诱导条件下，在DN3131和DN6262组可见明显的深褐色染色的矿化结节，且成团块状。在GC31组中，在部分细胞的外周有浅棕色钙沉积染色，为零星颗粒状散在分布。

3 讨论

水凝胶能够改良为可注射剂型，能够适合不规则的根管形态[14-15]，在牙髓再生研究中具有良好的应用前景。本研究选择的3组不同组分配比的可注射羟乙基壳聚糖基水凝胶，可通过注射器混合推出，在温和的生理条件下(37 ℃)发生溶胶-凝胶相转化，并且能充盈根管空腔，都具有良好的可操作性，同时，观察到不同组成配比的水凝胶的可操作时间有所不同。实际操作过程中，可操作时间与溶胶-凝胶相转化的时间直接相关，若相转化时间短，则在注射器内快速凝胶化后失去流动性，难以注射[16]。本研究GC与OHC-PEO-CHO间的凝胶化是由于动态共价键(亚胺键)的形成，反应较慢，可操作时间长。而双网络水凝胶中除外GC-OHC-PEO-CHO主网络, 还互穿海藻酸钠-CaCl2次网络，海藻酸钠与CaCl2间的离子键形成迅速，使双网络水凝胶的溶胶-凝胶相转化时间明显缩短，可操作时间缩短。当交联分子的浓度增大，交联反应速率加快，凝胶时间进一步减短，可注射性下降。本研究GC31、DN3131、DN6262的可注射性依次减小，当组分浓度进一步升高时，出现凝胶堵塞注射针管的情况，难以注射入根管内，故本研究未将更高组分浓度的双网络水凝胶纳入研究范畴。

对于水凝胶材料，通过调控各组分配比可以改变其力学性能和耐降解性能[11, 17-19]。与单网络水凝胶相比，双网络水凝胶因其互穿网络系统和有效的能量扩散，所以具备较强的韧性、机械强度和稳定性[20]。在双网络水凝胶中，在一定范围内，当凝胶交联分子的浓度升高，则机械性能增强、基质硬度增大、孔隙率降低[21]。本研究观察到双网络水凝胶的抗压缩性能、耐降解性能均优于单网络水凝胶组，且双网络水凝胶组中，组分浓度高的DN6262组的抗压缩性能、耐降解性能优于组分浓度较低的DN3131组，也证实了以上推论。既往学者研究表明，牙髓-牙本质复合体类似物形成的时间为3～6周不等，因此支架材料在这段时间内维持机械强度的稳定,实现营养物质和生物活性分子的传递将对细胞的分化有着积极的影响[3, 22-23]。

同其他支架材料相比，水凝胶作为可三维包封细胞的一种支架材料，形成干细胞龛(niche)，模拟细胞外基质与细胞的相互作用，调节其中细胞的自我更新能力和分化能力[24]。有研究表明[25]，同二维培养相比，3D微环境更能促进细胞的多向分化潜能，但对于细胞增殖行为的影响尚未确切[26]。目前的牙髓组织工程研究大多局限于将牙源性细胞种植在支架的表面，研究细胞在支架表面和内部的生物学行为[27-28]，而对三维培养细胞的行为改变研究相对较少见。本研究观察到细胞在水凝胶中均成球形生长，并形成细胞球形聚集体，这是由于细胞在凝胶中不与特定的黏附位点结合，使细胞与细胞间的接触和胞间信号交流增强[29]。有研究表明，水凝胶包封的球状体细胞更易存活[30]，更不易发生凋亡。

本研究构建的3组可注射型水凝胶对hDPCs增殖能力的促进作用不同，其可能原因是由于3组水凝胶理化性能不同，细胞感受到的细胞外基质硬度不同。细胞外基质硬度可作为机械刺激信号传递给细胞，影响细胞骨架的收缩和细胞有丝分裂通路的开启[31]，从而影响增殖行为。GC水凝胶网络中的GC与OHC-PEO-CHO利用席夫反应化学结合形成的动态交联键在细胞增殖的过程中维持着断裂和连接的自我平衡，有利于细胞间接触的同时又可以提供一个合适的增殖空间，促进了细胞的增殖行为。本研究观察到，在较为柔软的单网络水凝胶模拟的细胞外基质中，人牙髓细胞表现出较高的增殖能力，证实了以上推论。而双网络水凝胶由于海藻酸盐-钙离子通过离子键形成的次网络在GC主网络中穿插，使分子链的密集度升高，细胞的增殖空间减小，细胞在其中的增殖行为受到一定程度的抑制。随着交联分子浓度的升高和支架降解速度减慢，细胞的增殖空间更小，在四周束缚的环境中，细胞的增殖相应减缓[32]，本研究DN3131组和DN6262组内细胞的增殖能力较低，证实了以上推论。

随着水凝胶支架基质硬度的改变，细胞的分化行为也受到影响。有研究发现，基质硬度较高时，细胞骨架较为整齐，倾向生成矿化组织，而基质硬度较低时，倾向于生成类牙髓样软组织[4]。本实验中，双网络水凝胶模拟的细胞外基质的硬度较高，同时其耐降解性使得较高的硬度得以维持，观察到DN3131组和DN6262组内细胞成牙本质相关基因和矿化相关基因的表达水平和矿化结节生成水平均高于GC31组，说明双网络水凝胶与矿化诱导液协同作用促进了hDPCs成牙本质向分化行为。

本研究仅观察了不同组成配比的GC基水凝胶对hDPCs增殖和分化的影响，对其如何影响hDPCs增殖和分化的分子机制仍需进一步探讨；需要构建动物实验模型进行体内试验；需要进一步研究GC基水凝胶对生长因子的载体功能，深入探索其作为牙髓组织工程支架的作用机制，从而发挥其应用潜能。

综上所述，本研究制备的GC基单/双网络水凝胶均具有良好的根管内可注射性能，其中双网络GC基水凝胶具有更好的耐降解性和力学性能。hDPCs在各组水凝胶中均持续增殖，且GC31单网络水凝胶更有利于维持细胞的增殖活力。同单网络GC基水凝胶相比，双网络GC基水凝胶在体外实验中能更有效促进hDPCs的成牙本质向分化和矿化。