GRI2B基因多态性与闽南地区汉族人群癫痫的相关性研究

连霞 郑丽群 钱小容 赵佳丽 费燕

中图分类号 Q343.1+2：R742.1

文献标志码A

文章编号 1001-0408（ 2020）03-0348-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.19

摘要 目的：探讨N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚基基因GRIN2B多态性与闽南地区汉族人群癫痫的相关性。方法：采用回顾性研究方法，选取2017年1月-2018年5月在厦门大学附属东南医院进行体检的167例健康人员为对照组，监测过丙戊酸钠血药浓度的163例癫痫患者为癫痫组，采集两组受试者的临床资料及外周血。对受试者GRIN2B基因rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs74816802、rs2160517、rs2193149、rs966664、rs1805476、rs1806201、rs1805522、rs3764030、rs1019385等12個位点进行基因分型。采用Haploview 4.2软件进行连锁不平衡（LD）分析;采用Pearson相关性分析进行单倍型分析;采用基因型检验（GE-NO）、趋势X2检验（TREND）、显性基因检验（DOM）和隐性基因检验（REC）统计两组受试者GRIN2B基因12个位点的野生纯合子（AA）、突变杂合子（Aa）及突变纯合子（aa）基因型的分布差异;采用Logistic回归模型分析GRIN2B基因12个位点的致癫痫相关性。结果：两组受试者GRIN2B基因12个位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P> 0.05）;由rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs74816802、rs2160517、rs2193149、rs966664组成的结构域1（Blockl）和由rs3764030、rs1019385组成的Block2各位点之间存在明显LD现象（D>0.9，r2>1/3）.blockl中的CGGACAG单倍体与癫痫的发生存在相关性（P<0.05）;rs74816802、rs2193149位点在两组间分布的差异具有统计学意义（P<0.05）;rs2193149位点突变可能有致癫痫作用（等位基因的加和作用：OR=1.529，L95=1.017，P=0.041）。结论：GRIN2B基因rs2193149位点突变可能是闽南地区汉族人群癫痫致病的相关危险因素之一。关键词N-甲基-D-天冬氨酸;GRIN2B;基因多态性;癫痫;相关性

癫痫是神经细胞异常放电导致中枢神经系统功能失常的一种神经系统疾病[1]。N-甲基-D-天冬氨酸（Ⅳ-methyl-D-aspartate，NMDA）受体是广泛存在于大脑神经元细胞中的兴奋性谷氨酸受体，参与调节兴奋性突触传递，在脑发育、回路形成、细胞迁移和分化、突触重塑等方面发挥重要作用[2]。有研究表明，NMDA受体GRIN2B亚基过度激活是癫痫发作的一个重要原因[3-4]。但经检索未发现NMDA受体GRIN2B亚基基因与癫痫相关性的报道。本研究拟采用病例对照研究探讨NMDA受体GRIN2B亚基的12个位点基因多态性与癫痫的遗传易感相关性。

l 研究对象

采用回顾性研究方法，选取来厦门大学附属东南医院就诊的闽南地区汉族人，年龄18～60岁，其中进行体检的167例健康人员为对照组，监测过丙戊酸钠血药浓度的163例癫痫患者为癫痫组。癫痫患者入选标准：（1）按照国际抗癫痫联盟（ILAE）对癫痫发作及癫痫综合征的分类标准[5]诊断为癫痫;（2）经脑电图证实为癫痫;（3）病程≥6个月。排除标准：（1）外伤性癫痫;（2）有精神障碍或情感障碍等依从性差的患者;（3）有严重心、肺、肝、肾等功能障碍;（4）有中枢神经系统恶性肿瘤或变性疾病;（5）脑卒中或者颅内感染所致癫痫;（6）有药物滥用和酒精依赖患者。对照组的167例受试者中，男性83例、女性84例，年龄（38.6±19.2）岁，体质量指数（23.58±1.26） kg/m2;癫痫组的163例受试者中，男性89例、女性74例，年龄（40.3±15.9）岁，体质量指数（22.68±1.53）kg/m₂。两组受试者的性别、年龄、体质量指数差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求，患者本人或监护人均签署知情同意书。

2 方法

2.1 患者DNA提取

收集两组受试者的静脉血2mL，一周内采用美国Omega核酸提取试剂盒进行DNA提取与纯化，光密度（OD值）检测及1.25%琼脂糖凝胶电泳检测合格后将DNA转移至96孔板，-80℃保存备用，用于后面的基因分型等检测。

2.2 基因位点的选择及引物设计

在国家生物技术信息中心网站（The National Cen-ter for Biotechnology Information，NCBI; https：//www.nc-bi.nlm.nih.gov/）中查找基因，在GeneView（ http：//bc3.m-formatik.hu-berlin.de/）中选择该基因可能对蛋白质水平产生影响的单核苷酸多态性（SNP）位点，依据hapmap数据库或1000 Genomes数据库（http：//www.international-genome.org/），选取在中国汉族人群中最小等位基因频率（MAF）大于0.05，且等位基因对等分布的SNP位点，综合PubMed（PubMed.cn）和Google（ http：//www.google.cn）文献检索，所选位点通过美国国立卫生研究院网站（http：//snpinfo.niehs.Nih.gov/）上的相关功能进行预测，信息核实后筛选出易感性的SNP位点。结果筛选出与GRIN2B基因相关的12个SNP位点，包括rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs74816802、rs2160517、rs2193149、rs966664、rs18 05476、rs1806201、 rs18 05522、rs3764030.rs1019385。采用Assay Designer 3.1软件进行引物设计，包括上游引物、下游引物及延伸引物。GRIN2B基因12个位点的引物序列见表l。

2.3 基因分型

取“2.1”项下提取的DNA，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用虾碱性磷酸酶（SAP）去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物，再加入单碱基延伸引物，其3'末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用4种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基，进而进行SNP分型。参考文献[6]设置单碱基延伸反应条件：94℃预变性30s;94℃变性5s.52℃退火5s，80℃延伸5s，40个循环，其中每个循环中52℃退火和80℃延伸再进行5个循环;最后72℃延伸3min。

2.4 数据处理

采用Sequenom MassArray飞行时间质谱生物芯片系统，以x₂检验将对照组和癫痫组受试者GRIN2B基因12个SNP位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，比较观察值与预测值的差异，P>0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。采用Haploview 4.2软件对12个SNP位点进行连锁不平衡（LD）分析，即在某一群体中，不同座位上某两个等位基因出现在同一条单体型上的频率与预期的随机频率之间存在明显差异的现象。当D>0.9且r₂>1/3，则视为存在LD现象。采用Pearson相关性分析进行单倍体分析，用假阳性发现率（FDR）法进行多位点数据分析校正多重检验。采用SPSS 21.0和Plink l.07软件进行统计，组间基线数据中的连续变量符合正态分布，采用f检验，有序分类变量分析和两组间基因频率的比较采用X2检验。采用基因型检验（GENO）、趋势x₂检验（TREND）、显性基因检验（DOM）和隐性基因检验（REC）分析两组受试者GRIN2B基因的12个SNP位点野生纯合子（AA）、突变杂合子（Aa）及突变纯合子（aa）的基因型分布。校正年龄和性别后，构建携带GRIN2B等位基因与病例对照的Logistic回归模型，采用f检验，检测项目包括基因的加性效应（ADD）和基因显性效应（DOMDEV）。L95、U95代表预测值95%置信区间（CI），当优势比（0R）>1且L95>1时，表示该等位基因确实有致病作用;当OR<1且U95 <1时，表示该等位基因有保护作用;当OR-1时，表示该位点与疾病无任何关系。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果

本研究中GRIN2B基因的12个SNP位点基因型观察值与预测值比较，差异无统计学意义（P>0.05），各位点均符合Hardy-Weinberg平衡，表明该研究具有群体代表性。GRIN2B基因12个SNP位点的Hardy-Weinberg平衡情况见表2。

3.2 LD和单倍体分析结果

由rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs748168-02、rs2160517、rs2193149、rs966664組成的区块l（Blockl）和由rs3764030、rs1019385组成的Block2各位点之间存在明显LD现象，其D>0.9且r₂>1/3。进一步比较发现，对照组与癫痫组比较P>0.05，提示LD与癫痫发病不相关。GRIN2B基因12个SNP位点的LD分析结果见图1。

相邻SNP的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代，位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型。本研究的两个区块共构建出9个单体型，癫痫组与对照组比较，Blockl中的CGGACAG单体型差异有统计学意义（P<0.05），表明该单体型与癫痫的发生存在相关性。单倍体分析结果见表3。

3.3 基因型统计结果

TREND、DOM结果显示，rs74816802位点在两组受试者间的基因分布的差异有统计学意义（P<0.05）;GE—NO、TREND、DOM结果显示，rs2193149位点在两组受试者间的基因分布的差异有统计学意义（P<0.05）;其余SNP位点的组间基因分布的差异无统计学意义。两组受试者GRIN2B基因12个SNP位点基因型分布差异统计结果见表4。

3.4 Logistic回归分析结果

统计结果显示，GRIN2B基因rs2193149位点ADD项目的OR-1.529.L95 -1.017，P-0.041，提示rs2193149位点突变可能有致癫痫作用。GRIN2B基因12个SNP位点的Logistic回归分析结果见表5。

4 讨论

NMDA受体是在中枢神经系统广泛表达且参与神经传递的离子型谷氨酸受体[7]。NMDA受体由其亚基GRIN1、GRIN2A、GRrN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B组装为异四聚体结构，功能性NMDA受体则由2个GRINl亚基和2个GRIN2亚基组成，或者由2个GRIN1亚基和1个GRIN2亚基、1个GRIN3亚基组成[8]。在哺乳动物大脑中GRrN2B充当谷氨酸受体激动剂结合位点和主要的兴奋性神经递质受体，NMDA受体被激活后，引起Ca₂₊内流，细胞内Ca₂₊相关信号通路过度激活，导致神经元异常放电。癫痫的发生正是兴奋性神经元（NMDA电流）和抑制性神经元[y-氨基丁酸（GABA）电流]异常放电的结果[9]。癫痫的致病因素复杂，癫痫的家族遗传性被认为是癫痫发病的一个重要原因，从遗传学角度考虑，已有研究发现GRIN2B基因rs7301328位点基因多态性与帕金森病的发生发展相关[10];杨雅玲等[11]研究发现在中国不伴痴呆的帕金森病人群中，GRIN2B基因rs7301328位点的GG基因型可能是帕金森病相关幻觉的保护因素。由此可见，研究受体通道基因多态性对于癫痫的治疗具有重要的价值，可为癫痫患者的个体化治疗提供理论依据。

已有研究发现NMDA受体突变及罕见变异见于多种神经精神疾病[12]。一项包含258个NMDA受体突变及罕见变异的研究结果显示，49%的患者表现为癫痫;而GRIN2B/GluN2B变异患者主要表现为智力障碍（87%），其次是癫痫（29%）[11]。本研究通过对比闽南地区汉族癫痫患者与健康人员NMDA受体GRIN2B亚基基因多态性，探讨GRIN2B基因多态性与癫痫的关联性。研究发现，癫痫患者与健康人员的GRIN2B亚基基因rs74816802 .rs2193149位点基因型分布存在显著差异（P<0.05），且Logistic回归结果显示rs2193149位点OR>1.L95>1，提示GRIN2B亚基基因rs2193149位点的突变可能与癫痫易感性相关。但由于本研究样本量有限，主要为闽南地区汉族人，对课题的研究具有一定局限性。此外，癫痫发作类型多，存在多种综合征，个体间临床差异大，不同年龄致病因素不同，故对于GRIN2B基因位点多态性影响癫痫发生发展的确切分子机制尚有待进一步研究。

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（收稿日期：2019-09-18 修回日期：2019-12-16）

（编辑：邹丽娟）