近红外光谱在线采集技术检测华盖散提取液浓缩过程中的相关指标
2020-02-26封义玲罗晓健赖衍清蔡大宇饶小勇徐春良
封义玲 罗晓健 赖衍清 蔡大宇 饶小勇 徐春良
中图分类号 R95
文献标志码A
文章编号 1001-0408（2020）03-0303-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.10
摘要 目的：建立在线快速检测华盖散提取液浓缩过程中相关指标的方法，为其判断浓缩终点提供参考。方法：采用近红外光谱（ NIRS）在线采集装置采集华盖散提取液浓缩过程中73个浓缩液样品的在线光谱图，采用偏最小二乘法（PLS）建立NIRS与5个指标（浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量）间的定量校正模型，并用另外15个浓缩液样品模型进行验证，分析预测值与测量值之间的相关性。结果：所建立的定量校正模型中浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量的相关系数（R2）分别为0.9825、0.9999、0.9983、0.9994、0.9993，校正集均方根误差（RMSEC）分别为0.0016、0.0251、0.0147、0.0018、0.0009，交叉验证均方根误差（RMSECV）分别为0.002l、0.0358、0.0336、0.0063、0.0013。15个样品验证后，预测均方根误差（RMSEP）分别为0.0032、0.0246、0.0215、0.0077、0.0059。结论：本研究所建立的定量校正模型预测性良好，可为华盖散提取液浓缩终点的在线判断提供依据。
关键词 华盖散;浓缩过程;近红外光谱法;在线采集
浓缩是中药制剂生产过程中的重要工序之一，常规的浓缩终点判断多以经验为主，或采用相对密度作为终点判断的指标，但该方法无法反映浓缩过程中药效成分的变化和浓缩液质量的一致性，将直接影响后续制剂的质量[1]。因此中药浓缩过程中含固量和指标成分含量等的在线检测技术研究，对提高中药浓缩液质量具有重要意义。
美国FDA颁布的《PAT工业指南》提出PAT（过程分析技术）可以通过对过程的关键质量属性实时监控，从而确保最终产品质量[2]。近红外光谱（NIRS）法作为PAT的最常用技术，具有绿色、无损、快速等优点[3]。本课题组前期组装了NIRS在线采集装置，在实验室中进行浓缩过程的在线检测技术研究，模拟工业化生产过程，可为中药浓缩生产过程的在线检测提供参考。
华盖散出自《太平惠民和剂局方》[4]，记载曰：“治肺感寒邪，咳嗽上气，胸膈烦满，项背拘急，声重鼻塞，头昏目眩，痰气不利，呀呷有声”，该方由紫苏子（炒）、赤茯苓（去皮）、桑白皮（炙）、陈皮（去门）、杏仁（去皮、尖，炒）、麻黄（去根、节）、甘草（炙）等7味药材组成，主治风寒哮喘，现代临床上多用于治疗小儿咳嗽变异型哮喘[6]。该方为煮散剂，需患者自行煎煮，本课题组拟将该方制成颗粒剂，克服煎煮不便的问题。经过前期研究，确定了华盖散各组方饮片提取的工艺参数，现将NIRS法应用于华盖散提取液浓缩过程中，以浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量作为在线检测的指标，建立NIRS与上述指标的定量校正模型，并实时检测华盖散浓缩过程中各指标的变化，以期为NIRS法在华盖散提取液浓缩过程中的应用提供试验依据，并为中药浓缩过程中的终点判断、产品中间质量控制以及在线检测等提供有效、可靠的途径。
l 材料
1.1 仪器
E2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）;MS105型电子分析天平（瑞上梅特勒一托利多仪器有限公司）;YZN50型液体浓缩真空煎药机（北京东华原医疗设备有限责任公司）;QWWJ-200型全无油静音空压机（上海曲晨机电技术有限公司）;QBY-15型气动隔膜泵（温州同创机械科技有限公司）;DA 7440 GP型近红外分析仪（瑞上Perten公司）。
1.2 药品与试剂
麻黄、苦杏仁、紫苏子、陈皮（去门）、桑门皮、赤茯苓、甘草等7味药材均购自江西江中饮片有限公司，经江西中医药大学药学院刘勇教授鉴定为真品;盐酸麻黄碱对照品（批号：171241-201508，纯度：99.8%）、盐酸伪麻黄碱对照品（批号：171237-201510，纯度：99.8%）、苦杏仁苷对照品（批号：110820-201607，纯度：90.7%）均购自中国食品药品检定研究院;甲醇和乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。
2 方法与结果
2.1 华盖散浓缩液样品的制备与收集
称取麻黄、苦杏仁、紫苏子、桑门皮、赤茯苓、陈皮（去白）各0.5kg，甘草0.25kg，共3.25kg药材，加10倍量水（L/kg）于液体浓缩真空煎药机中提取，提取2次，每次90min，过滤，合并滤液;滤液于60℃、-0.06MPa条件下浓缩，浓缩过程中采集NIRS（NIRS在线采集装置由液体浓缩真空煎药机、气动隔膜泵、石英液体池、NIRS分析仪以及数据采集系统组成，详见图1）。溶液经气动隔膜泵输送至石英液体池中后循环回浓缩罐中，由NIRS分析仪采集数据，并连接NIRS工作站进行光信号的传递。保持溶液循环以采集实时光谱，在光谱采集过程中，关闭阀门b、c，打开阀门a，采集静态药液光谱，随后由可拆卸软管收集样本。每次浓缩过程约7h，前4h约每30min取样，后3h约每20min取样，每份30mL。共浓缩5次，收集88个样品（由于真空度或者升温速率的不同，每次的浓缩时间不完全相同，因此所得样品共88个）。取其中73个样品（编号：S1～S73）用于定量校正模型的建立;取另外15个样品用于模型的验证。NIRS在线采集装置图见图1。
2.2 华盖散浓缩液样品的NIRS在线模型图谱的建立
NIRS采集测量方式为透反射，光程为4mm，分辨率为5nm，光谱采集范围为950～1650nm，扫描速度为30次/秒，扫描时间为8秒，室内温度为（25±1）℃。取“2.1”项下收集的73个样品（编号：S1～S73），按上述条件进行扫描分析，并采集NIRS。华盖散浓缩液各样品的NIRS叠加图见圖2。
2.3 浓缩液密度的测定
在25℃的环境下，用移液管分别精密移取73个华盖散浓缩液样品各5mL（V），精密称定其质量（m）。每份样品平行测定3次，计算浓缩液密度（p，p=m/V）。结果，73个华盖散浓缩液样品的密度范围为1.01～1.09g/cm3。
2.4 含固量的测定
取73个量瓶置于105℃烘箱中烘干至恒质量，分别精密称定质量（m1）;精密移取73个华盖散浓缩液样品各5mL分别至上述量瓶中，精密称定质量（m2）;放入105℃烘箱烘干至恒质量，精密称定质量（m3）。每份样品平行测量3次，计算含固量[含固量=（m3-m1）/（m2-m1）Xl00%]。结果，73个华盖散浓缩液样品的含固量范围为0.79%～16.08%。
2.5 苦杏仁苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量测定
2.5.1 供试品溶液的制备取华盖散浓缩液样品（样品编号：Sl）适量，用水稀释至适当浓度，微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液。
2.5.2 阴性样品溶液的制备按照华盖散处方，分别制备缺苦杏仁和麻黄药材的阴性样品溶液。
2.5.3 对照品溶液的制备精密称取苦杏仁苷对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为36.95μg/mL的苦杏仁苷对照品溶液，备用;精密称取盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为49.70、50.01μg/mL的混合对照品溶液，备用。
2.5.4 色谱条件 （1）苦杏仁苷含量测定的色谱条件。色谱柱为PhenomenexSynergiTM Polar-RP 80A（250mmx4.6mm.4μm）;流动相为乙腈-水（6：94，V/V）;流速为1mL/min;检测波长为207nm;柱温为30℃;进样量为10μL。（2）盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量测定的色谱条件。参考2015年版《中国药典》（二部）中相关方法[6]，色谱柱为Phenomenex SynergiTM Polar-RP 80A（250 mmx4.6mm，4μm）;流动相为甲醇-水（含0.092%磷酸、0.04%三乙胺、0.02%二正丁胺）（1.5：98.5，V/V;流速为1mL/min;检测波长为210nm;柱温为30℃;进样量为10μL。
2.5.5 专属性考察分别吸取“2.5.1”～“2.5.3”项下供试品溶液、阴性样品溶液、各对照品溶液各10μL，按“2.5.4（1）（2）”项下色谱条件分别进样分析，记录色谱图。结果，供试品溶液中各组分在上述色谱条件下均分离良好，各阴性样品对苦杏，苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的测定均无干扰，表明该方法专属性良好。高效液相色谱图见图3。
2.5.6 线性关系考察分别以甲醇为溶剂制备含苦杏仁苷230.945、115.472、57.736、28.868、14.434，7.217μg/mL，盐酸麻黄碱248.50、124.25、62.13、31.06、15.53、7.77μg/mL，盐酸伪麻黄碱250.50、125.25、62.62、31.31、15.66、7.83μg/mL的系列质量浓度标准工作溶液。分别吸取上述溶液10μL，分别按“2.5.4（1）（2）”项下色谱条件进样分析。以苦杏，苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到回归方程。结果，苦杏仁苷的回归方程为y=10338x-31 097（r=0.9998），盐酸麻黄碱的回归方程为y=22 197x-37233（r=0.9999），盐酸伪麻黄碱的回归方程为y=22992x-52488（r=0.9999），三者分别在7.217～230.945、7.77～248.50、7.83～230.50μg/mL范围内线性关系良好。
2.5.7 精密度试验取“2.5.3”项下对照品溶液各适量，分别按“2.5.4（1）（2）”项下色谱条件连续进樣6次，记录峰面积。结果，苦杏，苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积的RSD分别为0.64%、0.12%、0.10%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.5.8 稳定性试验取华盖散浓缩液样品（样品编号：Sl），按照“2.5.1”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置O、2、4、8、12、24h后，分别按“2.5.4（1）（2）”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积的RSD分别为1.34%、1.09%、0.21%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定性良好。
2.5.9 重复性试验取华盖散浓缩液样品（样品编号：Sl），按“2.5.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别按“2.5.4（1）（2）”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积的RSD分别为0.93%、1.89%、1.37%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.5.10 含量测定 取73个华盖散浓缩液样品适量，按“2.5.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.5.4（1）（2）”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量。结果，苦杏仁苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量范围分别为0.1293～2.4053、0.0255～0.5137、0.0107～0.2407mg/mL。
2.6 数据处理、建模及模型验证
将采集的73个样品的NIRS与其所对应的浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量导入The Unscrambler 9.7软件（网址：https：//www.ca-mo.com/），选择合适的建模波段和光谱预处理方法，运用偏最小二乘（PLS）法计算[7]，采用交叉验证法，建立NIRS与各指标间的定量校正模型。
2.6.1 建模波段的选择华盖散浓缩液样品的光谱采集范围为950～1650nm。由于其溶剂是水，而纯水的NIRS在1440nm波长附近吸收峰较强，波谱较宽[8]，对样品吸收峰的干扰较大，且通常认为吸收度大于1.5的波长区间为饱和吸收，故建模时不宜采用这一波段的光谱[9]。因此，排除水的強吸收波段后，确定950～1375nm与1505～1650nm为建模波段。
2.6.2 NIRS定量校正模型相关参数的选择 NIRS定量校正模型以相关系数（R2）、校正均方根误差（RMSEC）、交叉验证均方根误差（RMSECV）和预测均方根误差（RMSEP）为指标优化建模参数。其中，R2越接近于1，说明模型的预测值与测量值的相关性越好;RMSEC和RMSECV越小且越接近，说明该模型稳定性越好，精确度越高;RMSEP越小，说明模型的预测效果越好[10]。
2.6.3 NIRS定量校正模型预处理方法的选择 在近红外透反射光谱的采集过程中，背景噪声和特定物理因素等会对NIRS产生影响，可能会造成光谱基线的偏移和噪音信号的放大[11]。因此在进行光谱分析之前，应对采集的原始光谱进行必要的预处理。本文选择了近红外光谱中常见的5种预处理方法[一阶导数+Savitzky-Golay平滑滤波、二阶导数+Savitzky-Golay平滑滤波、标准变量变换（SNV）、一阶导数+Savitzky-Golay平滑滤波+SNV、附加散射校正（MSC）]，比较了无预处理方法以及5种预处理方法对R2、RMSEC和RMSECV的影响，详见表1。
由表1可得，浓缩液密度可选用一阶导数+Savitz-ky-Golay平滑滤波进行预处理;含固量可选用一阶导数+Savitzky-Golay平滑滤波+SNV进行预处理;苦杏仁苷和盐酸伪麻黄碱含量不进行光谱预处理;盐酸麻黄碱含量选用MSC进行预处理。
2.6.4 主因子数的确定 在采用PLS建模的过程中，主因子数过少会导致信息不全，过多容易造成模型的过拟合，因此选择适合的主因子数有利于提高模型的预测性[12]。RMSECV越小，模型的精确度越高，其对应的主因子数即为最优主因子数[10]。主因子数与RMSECV的关系图见图4。
由图4可知，浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量的最优主因子数分别为8、8、10、9、8。
2.6.5 NIRS定量校正模型的建立将所有光谱和各组数据导入The Unscrambler 9.7软件后，经过上述确定的光谱预处理方法处理后，运用PLS和交叉验证法建立NIRS定量校正模型，并评价NIRS定量校正模型各指标的预测值与测量值的相关性，确定所建立的NIRS定量校正模型是否合理。结果，建立的NIRS定量校正模型中浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量等5种指标的R2分别为0.9825、0.9999、0.9983、0.9994、0.9993，RMSEC分别为0.0016、0.0251、0.0147、0.0018、0.0009，RMSECV分别为0.0021、0.0358、0.0336、0.0063、0.0013;NIRS定量校正模型的预测值与测量值间的相关性良好，表明所建立的NIRS定量校正模型合理，详见图5。
2.6.6 NIRS定量校正模型的验证采集“2.1”项下用于验证试验的15个样品的NIRS，并将上述建立的NIRS定量校正模型导入The Unscrambler 9.7软件中，分析浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量的预测值与测量值的相关性。结果，验证试验中浓缩液密度、含固量和苦杏仁苷、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量的R2分别为0.9237、0.9898、0.9959、0.9867、0.9611，RMSEP分别为0.0032、0.0246、0.0215、0.0077、0.0059;各指标预测值与测量值的相关性良好，详见图6。
3 讨论
华盖散方中麻黄和苦杏仁是君药与臣药，麻黄宣肺化痰、解表发汗为君，苦杏仁降气消痰、宣肺止咳为臣[13]。因而，麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁中的苦杏仁苷含量是工艺监测的重要指标。华盖散浓缩液密度与含固量则与制剂成型工艺息息相关。因此，本试验以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱及苦杏仁苷含量为化学指标，以浓缩液密度、含固量为物理指标，构建了一个多指标体系，为华盖散提取液浓缩过程的质量监控提供依据。
试验中选用石英液体池配合NIRS探头采集华盖散浓缩液的在线图谱。华盖散提取液不断循环，以保证采集其实时NIRS;同时，将石英液体池置于提取液循环的旁路，可采集静态提取液光谱，避免浓缩过程中产生气泡，干扰NIRS的采集。液体池选用石英玻璃，可减少由于器皿的吸光度对光谱采集准确性的影响;选用气动隔膜泵是因为其具有较强的自吸能力，可将溶液由浓缩罐中吸出1，使提取液循环，便于采集实时光谱。
本研究将NIRS法用于华盖散提取液的浓缩过程，建立了华盖散浓缩液中多指标同时在线测定的方法，解决了离线分析周期长的问题。该方法无需样品处理，操作简便、快速，可在线测定，后续可在实际生产中对所建立的模型进行完善和再校正，进一步提高模型在华盖散提取液浓缩过程的适用性与稳定性。
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（收稿日期：2019-08-11修回日期：2019-10-17）
（编辑：唐晓莲）
