骨形态生成蛋白在临床骨重建中的应用进展

蔡志杰 凌雅红 刘同明

骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一种由二聚物分子组成的疏水性酸性糖蛋白[1]。1965年，Urist[2]将脱钙牛骨植入肌肉及皮下，成功诱导异位成骨，由此认为骨基质中存在一种可以诱导骨形成的物质，并将之称为BMP。提取的天然BMP是由几种不同分子量蛋白组成的混合物，一个成熟的BMP分子是依赖半胱氨酸二硫键固定的双链(每链含有400个氨基酸)多肽二聚体分子,其重要结构中40%～50%与转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β高度同源。目前已确认的BMP家族成员达40多个[3]。经研究发现，BMP参与人体的物质代谢及不同组织器官的形成和发育，参与胚层和肢体的形成，与心血管、呼吸、胃肠、泌尿、生殖及神经系统的发育密切相关，并在发育期及成年后等各个时期都发挥不同作用[4-5]。在骨重建中，BMP是骨骼发育和维持成人骨稳态所必需的蛋白，且在骨折愈合过程中发挥重要作用[6]。在BMP家族亚型中，BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8和BMP-9都有促进成骨的作用，临床上BMP-2，BMP-4和BMP-7应用较多[7-12]。下文对BMP-2，BMP-4和BMP-7在临床骨重建中的应用加以综述。

一、BMP的信号传导途径

有研究结果表明，BMP的信号传导过程主要是通过BMP与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合完成的，这些受体又分为Ⅰ型和Ⅱ型，其结构相似，都包括胞外区、跨膜区及胞内区[13-15]。胞外区富含糖基化半胱氨酸，负责配体的识别和结合，在细胞外形成丝苏氨酸四聚体复合物，激活受体磷酸化后经过跨膜区进入细胞内。胞内区是富含丝氨酸/苏氨酸激酶的高度同源结构域，可激活下游信号。细胞内传导途径主要有2种:一种是Smad依赖性途径，即BMP配体、BMP受体和Smad分子介导的途径；另一种是非Smad依赖途径，即丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)p38途径[15-16]。(1)Smad依赖性途径：Smad依赖性传导途径是通过Smad分子介导。Smad分子有2个高度保守结构域，即氨基末端的Mad同源1(MH1)和梭基末端的Mad同源2(MH2)，两者之间由不同序列氨基酸连接。其中所有Smad分子具有MH2结构域，而MH1存在于Smad1/5/8(受体激活的Smad，R-Smad) 和 Smad4(通用Smad，Co-Smad)中。MH1结构域具有DNA连接功能；MH2结构域具有效应分子的功能。在R-Smad梭基末端还有特征性SSXS序列，是BMPⅠ型受体磷酸化位点[16-17]。BMP与细胞膜表面Ⅰ、Ⅱ型受体结合形成复合物，Ⅱ型受体自身磷酸化被激活，Ⅰ型受体被磷酸化Ⅱ型受体激活。磷酸化Ⅰ型受体与R-Smads结合，导致R-Smads羧基末端SSXS序列磷酸化，有活性的R-Smads形成，两分子磷酸化的R-Smads同聚化并与一分子Co-Smads结合从而形成三聚体复合物，复合物进入细胞核，转录Runx2等相关基因的表达，从而调节成骨细胞相关基因的表达，以达到骨再生和骨重建的目的[18-19]。(2)非Smad依赖途径：在非Smad依赖途径中，BPM不仅能与细胞膜上的BMP-Ⅰ受体结合，还能继续与游离的BMP-Ⅱ受体进行特异性结合，再通过受体结合蛋白使TGF-β激活激酶(TGF-β activated kinase，TAK)连接蛋白(TAK binding protein，TAB)被激活，激活的TAB可在X染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP)的作用下形成TAB-TAK复合物，而TAK下游的MAPK细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、p38、JNK被激活发生经典的三级酶促级联反应，从而使MAPK激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)被磷酸化激活，进而磷酸化激活MAPK激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MAPKK)，最后发生丝氨酸和酪氨酸两个位点的磷酸化，从而激活MAPK[20-22]，进入细胞核调控细胞核内的Runx2等相关基因的转录与翻译[23]，调节成骨细胞的相关基因表达，以达到骨再生和骨重建(bone remodeling)的结局。

二、骨重建

骨重建是由破骨细胞去除老的或损坏的骨骼(骨吸收)，随后由成骨细胞形成新骨(骨形成)的一个持续的终身性过程。在骨重建中，骨吸收和骨形成之间保持着动态平衡[24]。成骨细胞和破骨细胞在骨重建中起关键作用，这两种细胞的协同作用承担着整个生命体的骨重建任务。成骨细胞是骨形成细胞，来源于骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，可分泌大量矿化基质并增殖分化形成骨细胞，骨细胞包埋进矿化基质形成骨；破骨细胞是一种多核细胞，起源于造血系统单核细胞，起到骨骼溶解作用[25-26]。破骨细胞可能通过表达和合成BMP来促进骨形成，从而促进成骨细胞在骨吸收部位的聚集、增殖和分化[27]。另外，BMP主要诱导未分化的间充质细胞分化为软骨和新生骨,其诱导成骨作用可分为趋化期、分化期、骨质形成期和重塑期[28]。Shimizu等[29]的研究结果表明，BMP是骨形成激动剂，诱导成骨作用显著，且受到其他细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血小板衍生因子(platelet derived gowth factor，PDGF)等的协同或抑制，而TNF-α作为骨吸收激动剂和骨形成抑制剂，是由成骨细胞产生并以自分泌方式抑制自身功能的。

三、BMP在临床骨重建中的应用

1.BMP-2在临床骨重建中的应用：2002年重组人BMP(recombined human bone morphogenetic protein,rhBMP)-2和rhBMP-7被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准应用于治疗骨不连、胫骨开放性骨折以及牙槽骨缺损等，并被广泛应用于临床[30]。Richards和Anderson[31]在对rhBMP-2在四肢骨折治疗应用的探索中发现其最佳应用剂量为4.2～8.4 mg。Rearick等[32]对48例经足踝部融合或骨折骨不连高风险患者进行了回顾性分析，用rhBMP-2作为骨愈合的增强剂，得出结论为rhBMP-2是一种安全有效的足踝高危手术骨愈合辅助剂。镇万源等[33]对106例因腰椎退变接受融合手术的患者进行了回顾性研究，发现腰椎间盘融合术中融合器植入BMP-2骨修复材料疗效显著,不仅能够提供即刻的生物学稳定性,达到有效的结构性支撑作用,而且还能促进患者椎间隙前后缘高度的恢复，明显改善患者术后疼痛症状。陈启刚等[34]在对15例SandersⅢ、Ⅳ型跟骨骨折患者进行的回顾性随访中发现锁定接骨板结合rhBMP骨修复材料治疗跟骨骨折可有效维持跟骨解剖形态,促进骨愈合,减少了骨折不愈合的发生率。王军等[35]对59例创伤性骨髓炎患者进行了回顾性分析，发现利用硫酸钙+万古霉素+BMP-2一期复合植入模式治疗创伤性骨髓炎成骨可靠且安全性高，并发症发生率低，抗感染效果满意。卢岩岩等[36]采用髓芯减压自体髂骨打压植骨联合BMP-2治疗38例(52髋)早中期缺血性股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)患者，可延缓或稳定疾病，阻止股骨头塌陷，推迟甚至避免关节置换术，取得了令人比较满意的疗效。程文俊等[37]采用改良髓芯减压技术结合组织工程化自体骨、异体骨、BMP-2复合物治疗国际骨循环研究会(Association Research Circulation Osseous，ARCO)分期Ⅱ期、ⅢA期股骨头坏死患者，中期结果是可有效改善患髋功能，在一定程度上可以延缓股骨头坏死进程。胡磊等[38]对2012年6月至2015年7月收治的64例A型脊柱胸腰段骨折患者进行回顾性病例对照研究，发现与单纯后路伤椎椎弓根钉内固定椎体内植骨比较,采取后路伤椎椎弓根钉内固定椎体内植骨联合rhBMP-2治疗A型胸腰椎骨折可恢复椎体稳定性,缩短骨折愈合时间,降低并发症发生率。

周思睿等[39]在动物实验中利用载有rhBMP-2和聚乳酸缓释微球的复合生物支架修复一定范围内的犬桡骨临界骨缺损(长骨干缺损达到长骨干直径的1.5倍)，发现这一方法能有效减少自体骨移植量，为进一步研究临界及超临界骨缺损的治疗与修复提供了实验依据。苗莹珂[40]构建的载有BMP-2的聚乳酸-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)微球与纳米纤维复合支架作为一种有蛋白缓释载体的复合支架材料能够应用于骨修复,在大鼠体内能够诱导成骨细胞分化为成熟骨细胞,进而形成矿化基质,具有异位成骨和原位骨缺损修复的能力，从而为临床应用提供更多的选择。有研究者利用固相多肽合成法合成含有17个氨基酸的新型短肽P17-BMP-2，不仅在体外具有促进大鼠MSC增殖的活性并诱导MSC分化成骨，而且负载于胶原基纳米羟基磷灰石/左旋聚乳酸(nano-hydroxyapatite/poly-L-lacticacid，nHAC/PLLA)中，有较好的缓释效果[41]。Wang等[42]在大鼠实验测试中发现BMP-2比BMP-4能更有效驱动多能干细胞向软骨细胞分化，并在体内持续影响软骨祖细胞，使软骨祖细胞走向更成熟的表型。朱乐全等[43]在大白兔实验研究中发现BMP-2基因转染的MSC与纤维蛋白胶的混合物可以促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合。Tan等[44]在大鼠穿刺型椎间盘退变(IDD)模型中发现，rhBMP-2通过白细胞介素(interleukin,IL)-6、TNF-α和IL-10来显著降低髓核组织和细胞的炎性反应，从而抑制髓核细胞凋亡，降低基质蛋白，减轻椎间盘退变，从而为椎间盘退变的治疗提供了新的思路。常晓朋等[45]从细胞及基因水平揭示BMP-2和TGF-β2具有协同促进MSC成骨分化的机制，为骨细胞的再生提供了实验和理论基础。周慧芳[46]用第3代慢病毒载体将BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7和BMP-9导入小鼠MSC(MC3T3-E1)，使其有效表达，促进MC3T3-E1向成骨细胞分化，另外BMP-2和BMP-7双基因联合转染能有效提高成骨转化，这为组织工程学骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。卢小娟[47]通过利用新西兰兔进行实验研究发现，BMP-9对骨缺损的成骨修复作用强于BMP-2，为后期BMP家族的临床应用提供了更开阔的思路。

2．BMP-4在临床骨重建中的应用：石少辉等[48]通过采用免疫组化方法测量发现， ONFH患者硬化带形成与BMP-4表达强弱呈正相关，BMP-4的高表达可能促进硬化带的形成，因此可在临床上应用以延缓关节置换时间。Wu等[49]发现同源盒基因MEIS2在维持牙髓MSCs成骨分化潜能方面起着重要作用，而MSCs是一种可靠的有应用前景的牙、骨等组织再生细胞来源，受到BMP-4刺激后MEIS2表达明显上调，从而促进MSCs成骨分化，达到骨组织再生的目的。李珏丹等[50]用免疫磁珠法分离培养人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，观察细胞生长情况，鉴定细胞的表型(CDl46、CD44和CD34)和多项分化潜能(成骨、成脂)，发现BMP-4、BMP-7和BMP-4+BMP-7均可促进PDLSCs增殖和成骨分化，BMP4+BMP7联合作用时细胞增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性更强，具有协同作用，为BMP在口腔医学临床应用提供了依据。

Umebayashi等[51]在利用大鼠进行的实验中将含有BMP-4的AcGFP质粒载体与2%牛集胶原和β-磷酸三钙颗粒混合，制成基因激活基质(gene activation matrixs，GAMs),将GAMs冻干移植到颅骨上,第8周在含1 mg BMP-4的标本中检测到骨形成，从而验证了BMP-4的成骨作用。杨明[52]在动物实验中用缺陷型单纯疱疹病毒载体系统建立组织工程骨，在体外使骨髓MSCs安全高效稳定表达血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF165)及BMP-4基因，具有显著的体外成骨作用，在体内可以促进成骨和血管化作用，对缺损兔桡骨具有良好的骨传导性及骨诱导性，与自体骨移植效果相近。姜明宇等[53]在大鼠实验中发现将BMP-4基因转入骨髓MSCs后，可以治疗先天性脊柱裂畸形。Huang等[54]利用毕赤酵母的密码子相对同义密码子使用值，对人BMP-4 (human BMP-4，hBMP-4) 成熟结构域的DNA序列进行了优化，在摇瓶培养的毕赤酵母中，优化序列(48 mg/L)hBMP4蛋白表达水平比原序列(12 mg/L) hBMP-4提高了4倍，通过检测细胞增殖和诱导小鼠异位软骨形成，优化后的DNA序列能显著提高毕赤酵母中hBMP-4蛋白的表达，并能产生更具有生物学活性的重组hBMP-4，在异源蛋白表达系统中生产出更多的可用于临床的具有生物活性的BMP-4，从而为BMP4的高效合成提供了方法。曹一汀[55]通过PCR(qRT-PCR)研究发现，升高的BMP-2和BMP-4主要来源于软骨下骨，这一结果提示碱性成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)通过调控软骨下骨活性上调其BMP表达水平，进而促进关节软骨的损伤修复，由此构建的定向释放FGF2的胶原基复合材料可能成为一种有应用前景的促进关节软骨修复的新型生物材料，并在家兔关节软骨修复中得以证实。陈临新等[56]构建了表达BMP-4的腺病毒载体系统,并成功转染脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，在体外通过ELISA法检测BMP-4基因修饰ADSCs软骨相关蛋白的表达情况，通过动物实验证实体内BMP-4基因修饰的ADSCs复合藻酸钙凝胶支架可修复小型猪膝关节软骨缺损，为临床软骨损伤的修复提供了一种选择。

3.BMP-7在临床骨重建中的应用：重组BMP于2001年8月在英国上市，Giannoudis和Tzioupis[57]对BMP-7在持续性骨折不愈合、假体周围骨折治疗和骨切除、髋臼重建后骨折愈合，牵张成骨、游离腓骨移植和关节融合术等各种临床条件下的适应证类型和疗效进行了评价，653例患者成功率为82%(535例)，未见局部或全身不良反应，因此认为BMP-7作为一种骨刺激剂是安全可靠的，可以被作为外科医生对骨折进行手术治疗的一种强有力的辅助手段。Friedlaender等[58]通过122例BMP-7治疗胫骨骨不连的大规模多中心临床试验发现，采用BMP-7治疗胫骨骨不连与自体骨移植相比具有无供区疼痛、出血少和手术时间大大缩短等优势，安全有效。Dimitriou等[59]使用rhBMP-7治疗连续25例骨折不愈合患者，利用临床和放射学相结合的评估方法，平均随访时间为4.2个月，未见并发症或不良反应，认为rhBMP-7作为骨刺激剂是安全的，并且建议在手术中应考虑使用rhBMP-7来治疗骨折不愈合。Papanna等[60]在应用BMP-7局部植入治疗四肢耐药骨折不愈合的安全性和有效性研究中，通过采用源自牛骨的胶原蛋白糊剂中局部植入BMP-7治疗52例患者，进行平均时间为5.6个月的临床和放射学随访，认为将BMP-7植入牛源性胶原糊剂中对四肢抵抗性骨折不愈合的治疗可起到有效辅助作用。Singh等[61]在2004至2011年对连续接受BMP-7治疗的患者进行前瞻性随访，对骨折愈合情况进行定期放射学和临床评估，直至患者骨折愈合，认为应用BMP-7可以成功治疗顽固性上肢骨折不愈合。Zimmermann等[62]对BMP-7与同种异体移植物对胫骨骨折延迟愈合患者的治疗效果进行了评估，对26例接受同种异体移植物患者使用BMP-7单一剂量3.5 mg粉末与2 ml患者血液、1 mg胶原的混合物，用止血海绵将其固定在在植入区域，其中24例患者骨折愈合，认为BMP-7有较高的缺陷修复能力。还有学者采用复乳溶剂挥发法(W1/O/W2)分别制备负载BMP-2和BMP-7的2种聚乙丙交酯-聚乙二醇(polyglycolide-polyethylene glycol，PGLA-PEG)微球，使BMP在体外实验中缓慢释放，使细胞活性长期表达，效果优于传统的聚已内酯(polycaprolactone，PCL)支架，为临床应用新型BMP材料提供了实验依据[63]。Ashraf和Gillgrass[64]进行了前瞻性Ⅱ期临床试验，对平均年龄为10.4岁的9例和2例分别因单侧和双侧牙槽间隙接受手术治疗的患者植入rhBMP-7，术后6个月行咬合X线检查评价牙槽裂隙部位骨形成情况，随访10年，观察BMP-7对正畸治疗和上颌生长的影响，其中单侧牙槽裂患者X线检查结果显示Kindelan评分为1或2级的患儿骨形成良好，移植成功的儿童接受了常规的正畸随访，上颌生长与自体骨移植效果相似，未见长期并发症和骨形成模式异常，为rhBMP-7在儿童牙槽骨缺损重建中的应用提供了独特的证据。

曲福军等[65]构建转染BMP-7基因组织工程软骨，用以修复家兔膝关节软骨缺损，在实验中发现转染与未转染BMP-7基因组织工程软骨对家兔膝关节软骨缺损均有修复作用,但转染BMP-7基因组织工程软骨的修复作用更强。贝抗胜等[66]经研究证实BMP-7在体外可以促进和诱导骨膜细胞向成骨细胞分化。Schlickewei等[67]制备一种可作为生物活性骨替代材料的可注射DNA负载纳米磷酸钙糊剂，发现BMP-7和VEGF-A-编码磷酸钙纳米粒DNA负载骨糊剂使兔模型中临界大小骨缺损的愈合速度明显加快。Chen等[68]在裸鼠实验中将人BMP-7重组腺病毒稳定转染至人真皮源性成纤维细胞(human dermal-derived fibroblast cells，hDDFCs)中，发现腺病毒介导的BMP-7表达可促进hDDFCs的成骨分化，增强成骨细胞相关基因的表达，对hDDFC成骨有明显促进作用，证实以BMP-7表达的腺病毒转染hDDFC是一种有效的骨组织工程修复工具。

BMP-2、BMP-4和BMP-7的临床应用基本都是以重组BMP载体等形式促进骨愈合，从而达到骨重建的目的。骨重建成功的关键在于术者操作的精细程度，将不愈合组织彻底切除，稳定固定以及对骨的轴线、长度和扭转的恢复，而BMP仅仅是促进骨折的愈合，并不能起到代替作用[69]。其中BMP-4在骨重建过程的主要作用是刺激骨硬化，起到对BMP-2和BMP-7的协同作用[70]。BMP-4在骨、眼、胃肠、心血管、神经系统甚至肿瘤等相关疾病中均有不同形式的表达[71],目前在骨科临床应用较少，主要用于组织工程学方面的研究，现有研究结果有待进一步临床实验证实；BMP-2和BMP-7在骨重建中的主要作用是诱导MSC向成骨细胞分化，成骨分化受到由多个BMP组成的复杂网络调控，在分化过程中存在选择性的表达增加和减少，其中BMP-2是这一网络的中央调节器[72-73]。在软骨形成和成骨过程以及血管重建过程中，BMP-2的作用甚至被认为是必不可少的[74]。

四、小结

综上所述，BMP在临床骨重建中的应用主要是通过一系列的信号传导诱导未分化MSC的基因表达，促使MSC分化为软骨和新生骨，BMP家族成员相互协调、协同作用，从而达到促进骨重建的目的。BMP在骨折愈合过程中不仅能促进骨的生物学稳定性，而且能起到骨支撑作用，从而成为临床应用较多的骨修复材料。但是BMP存在降解快、成本高、所需剂量大以及可能导致溶骨、异位骨化和局部炎症等诸多缺点，使其临床应用受到限制。BMP-2在骨重建中的作用最重要，在临床的应用也最为广泛。但是，BMP-2合成材料存在不能长久缓慢释放等缺点，还需要生物工程材料的改进。另外，BMP-9在骨修复重建中的作用优于BMP-2，BMP-4在骨、眼、胃肠、心血管、神经系统甚至肿瘤等相关疾病中均有不同形式的表达，由此可见BMP家族仍存在更多的探索空间，伴随着科技的进步以及多学科的协作，BMP家族可能被更多应用于临床。目前大多数BMP相关研究仍处于动物实验阶段，如何使BMP在临床应用中形成稳定持续缓慢释放的诱导物质，又不导致溶骨、炎症以及异位骨化，从而促进骨折愈合和腱-骨愈合，最终完成促进骨重建的作用，尚需要更深入长久的多学科研究探索。