钙网织蛋白-短发夹RNA 慢病毒载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 中钙网织蛋白表达的影响△

高树峰，杨明福，张克辉，游龙贵，王富华，王心涛，刘遗斌，罗冬，蔡云香

赣州市人民医院耳鼻咽喉头颈外科，江西 赣州3410000

喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤，发病率高，在中国，其占全身肿瘤的1%～2%，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的11%～22%。早期喉癌的治疗方法以手术或放疗为主，中晚期喉癌的治疗方法为以手术为主的综合治疗。虽然目前的治疗手段提高了喉癌患者的5 年生存率，但术后复发和转移仍是喉癌患者的主要死因[1-2]。因此，寻找有效、简便、不良反应小的新治疗方法成为耳鼻咽喉科工作者关注的焦点。喉癌的发生是以癌基因的激活和抑癌基因的失活为基础的多步骤、多阶段过程，因此，寻找阻断癌基因激活与抑癌基因失活的靶向基因是目前研究的工作重点[3-4]。钙网织蛋白（cal‐reticulin，CRT）具有促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞并破坏肿瘤细胞的功能，当细胞凋亡时，CRT 会发生簇集，与相关蛋白所识别的磷脂酰丝氨酸（phos‐phatidylserine，Ps）、C1q 形成“来吃我”信号识别复合体，启动清除、吞噬过程，同时，促使凋亡细胞被树突状细胞（dendritic cell，DC）等识别并呈递给CD4+和CD8+，从而激发抗肿瘤免疫应答[5]。为了探究CRT 在喉癌发展过程中的可能机制，本研究自行设计并构建了CRT-短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体，鉴定了其对人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 中CRT基因的沉默效果，为后续研究CRT基因功能奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶EcoRⅡ、BamHⅠ、T4DNA 连接酶及DNA 凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa 公司；DH5α大肠杆菌购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司；慢病毒包装细胞293T 细胞、Lipofectami‐neTM2000 转染试剂、SYBR Green qPCR SuperMix 试剂盒、immobilon western chemilum HRP substrate 试剂均购自Invitrogen 公司；高纯度质粒小提试剂盒、胎牛血清均购自Hyclone 公司；LymphoprepTM分离液购自NycoPrep 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、CRT 抗体、兔抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体均购自Abcam 公司；人喉鳞状细胞癌上皮细胞Hep-2 购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 方法

1.2.1 人CRT siRNA 靶序列的设计合成及表达载体构建 通过国家生物技术信息中心（the Nation‐al Center for Biotechnology Information，NCBI）检索人CRT基因信息，获取CRT基因核苷酸序列，使用相关的siRNA 干扰序列设计软件并经Blast 比对分析同源性后，选择3 条特异性较高的核心编码序列（coding sequence，CDS），分 别 命 名 为siRNA1（GAGAAAGATAAAGGTTTGCAGACAAGCCAG ‐GATGCACGCT）、siRNA2（CAACAGCCAGGTG‐GAGTCCGGCTCCTTGGAAGACGATTGG）和siR‐NA3（ACGAGACGTGGGGCGTAACAAAGGCAG‐CAGAGAAACAAAT），同时选择一条无意义的序列作为阴性对照，命名为Negative siRNA（TAT‐CAGCACGTGTCAGTACG）。将这4 条序列构建成稳定的表达载体CRT siRNA（1、2、3）-pSIH1-H1-copGFP 和Negative siRNA-pSIH1-H1-copGFP，将构建好的载体转化至大肠杆菌中进行扩增培养，挑取单克隆菌落进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）鉴定，并对阳性单克隆菌液进行测序。

1.2.2 有效序列的筛选 采用高纯度质粒小提取试剂盒提取纯化CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 质粒，然后利用LipofectamineTM2000 转染试剂分别将其转入培养的喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 中，通过实时PCR 检测细胞中CRTmRNA 的相对表达量，以β-actin基因为内参基因。基因表达效率=（1-siR‐NA 序列mRNA 占空白对照组的百分比）/转染率。选择一条沉默效率最高的CRT siRNA。

1.2.3 慢病毒载体的包装及滴度测定 选择沉默效率最高的CRT siRNA 包装生产CRT-shRNA 慢病毒。具体操作方法：用限制性内切酶EcoRⅡ、BamHⅠ将pLVX-shRNA 载体双酶切后，用DNA 凝胶回收试剂盒纯化回收线性片段，再使用T4 DNA连接酶将回收的载体片段与CRT siRNA 片段连接。经PCR 鉴定为阳性且测序正确的载体命名为Lv-CRT shRNA。将Lv-CRT shRNA 质粒与包装质粒导入293T 细胞中，获得高滴度的慢病毒。将高滴度的慢病毒按照10 倍梯度稀释后转染293T 细胞，培养48 h 后，用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数并计算慢病毒滴度。

1.2.4 慢病毒载体体外感染 取培养状态良好的第二代喉癌细胞系Hep-2，感染实验前24 h 进行接种，使用Ham’s F-12+10%胎牛血清（fetal calf se‐rum，FBS）的完全培养基，于37 ℃、5%CO2条件下培养，然后使用CRT siRNA-慢病毒液感染，添加病毒液，感染复数（multiplicity of infection，MOI）为30。感染后24 h 进行换液，换液后72、96 h 于显微镜下观察细胞有无绿色荧光蛋白表达，并进行传代、培养，传代后24、72 h 分别观察，然后继续做传代培养。

1.2.5 基因及蛋白表达水平检测 取传代培养细胞菌液，提取总RNA 和总蛋白，进行实时PCR 和蛋白质印迹法（Western blot）检测。实验分为3 组，即空白对照组（喉鳞状细胞癌细胞Hep-2）、阴性对照组（喉鳞状细胞癌细胞Hep-2+Lv-Negative shR‐NA）、shRNA 组（喉鳞状细胞癌细胞Hep-2+Lv-CRT shRNA）。采用实时PCR 检测3 组喉鳞状细胞癌 细 胞Hep-2 中CRT基 因 的 表 达 量：取10 μg 总RNA，以Oligo（dT）为引物反转录合成cDNA 后，取5 μl cDNA 模板，使用SYBR Green qPCR superMix试剂盒进行荧光定量检测。CRT基因的上游引物 为5'-ACTGTACTGATCATACGAGACG-3'，下 游引物为5'-CAGCGTCCAATTTGTTTCTCTGC-3'。β-actin基因的上游引物为5'-CTCCATCCTGGCCTC‐GCTGT-3'，下游引物为5'-GCTGTCACCTTCACC‐GTTCC-3'。PCR 反应条件：95 ℃3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，共36 个循环。反应结束后，导出计算结果，采用2-ΔΔCt法对CRT基因的表达进行相对定量分析。Western blot 检测方法：提取3 组喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 总蛋白后，采用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行初步定量，每组取等量蛋白进行上样，采用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（so‐dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophore‐sis，SDS-PAGE）进行凝胶电泳后，将目的条带转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST（Tris-HCl Strip Buf‐fer Tween）缓冲液封闭转膜1 h，室温下与一抗（CRT 抗体）孵育2 h，洗去未结合一抗，再于室温下与二抗（兔抗人IgG 抗体）孵育1 h，洗去未结合二抗，于杂交膜上加入immobilon western chemilum HRP substrate，反应5 min 后，于暗室进行曝光、显影、定影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0、SAS 9.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。相关性分析采用Spearman 秩相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人CRT siRNA 表达载体的鉴定

CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 表达载体的PCR 产 物 大 小 为240 bp，Negative siRNA-pSIH1-H1-copGFP 的PCR 产 物 为220 bp。PCR 阳 性 鉴 定及测序分析结果显示，插入片段的序列及方向均与预期结果一致。（图1）

图1 PCR阳性鉴定结果

2.2 有效序列的筛选

含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2、CRT siR‐NA3 的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 的表达量均低于空白对照，差异均有统计学意义（P＜0.05）。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2 的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 的基因表达效率均低于CRT siRNA3，差异均有统计学意义（P＜0.05）。含不同靶序列的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 后的表达量和表达效率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同靶序列的基因表达情况（±s）

表1 不同靶序列的基因表达情况（±s）

注：a与空白对照比较，P＜0.05；b与CRT siRNA3比较，P＜0.05

靶序列CRT siRNA1 CRT siRNA2 CRT siRNA3 Negative siRNA空白对照F值P值表达量1.24±0.22a 1.64±0.31a 0.84±0.20a 3.61±0.53 3.66±0.54 40.096＜0.05转染率（%）92.05±1.36 90.13±1.05 91.68±1.24 90.32±1.14—1.918＞0.05表达效率（%）71.73±1.18b 61.45±1.26b 84.78±0.95 1.34±0.41—316.910＜0.05

2.3 慢病毒载体的滴度测定及感染情况

经测定，慢病毒载体的滴度为3.5×107TU/ml，MOI=30 时，慢病毒转染至Hep-2 细胞的转染率在90%以上。

2.4 基因及蛋白表达水平

实时PCR 结果显示，空白对照组和阴性对照组喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 中CRT基因的表达水平分别为（3.662±0.023）和（3.620±0.031），两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；shRNA 组喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 中CRT基因的表达水平为（0.829±0.006），低于空白对照组和阴性对照组，差异 均 有 统 计 学 意 义（t=206.434、245.783，P＜0.05）。Western blot 结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，shRNA 组喉癌Hep-2 细胞中CRT 蛋白的表达水平明显下降。

3 讨论

CRT 是一种主要存在于内质网膜上的Ca2+结合蛋白，也存在于细胞毒性T 淋巴细胞的胞浆颗粒和嗜中性粒细胞表面，由单一基因编码，位于人19号染色体，包含9 个外显子，具有高度的进化保守性。CRT 最初被认为仅参与了Ca2+平衡的调节。随着研究的不断深入，发现CRT 在抑制肿瘤血管生成、抗原呈递和细胞凋亡中也具有重要作用[6-8]。细胞发生凋亡时，CRT 发生簇集并与相关蛋白结合形成“来吃我”信号识别复合体，清除、吞噬巨噬细胞[9]。CRT 能够引起E7 抗原特异性分泌γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ），使CD4+T 淋巴细胞明显增殖，从而发挥抗肿瘤作用，还能通过“交叉启动”效应增强细胞核因子对肿瘤特异性抗原的免疫原性，从而增强机体的抗肿瘤能力[10]。近年来，又发现CRT 能够被蒽环类抗生素诱导表达于细胞表面，并促使树突状细胞的吞噬及细胞毒性T 淋巴细胞产生免疫应答，增强蒽环类抗生素的化疗效果[11]。研究发现，白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、脑癌和胆囊癌的肿瘤细胞表面均表达CRT，肿瘤细胞的侵袭性增强，肿瘤细胞中CRT 的表达水平也相应升高，而大多数正常细胞群表面不表达或弱表达CRT[12-14]。Boasman 等[15]发现肿瘤细胞表面的CRT 具有促进巨噬细胞吞噬并破坏这些肿瘤细胞的功能，大多数肿瘤细胞不会受到巨噬细胞攻击的原因是这些肿瘤细胞同时还表达另外一种分子CD47，从而抵消了CRT 促吞噬的信号。通过沉默CRT基因在肿瘤细胞的表达反向证明CRT的过表达在肿瘤发展中的作用，可能会给以CRT为靶点的基因治疗提供新途径。

RNAi 技术能以少量的dsRNA 达到同源基因特异性沉默的目的，其作用原理是siRNA 与其对应的内源基因mRNA 特异性结合，阻止翻译过程，从而达到基因沉默的效果，是研究基因功能、表达调控机制及基因治疗领域的关键技术[16]。RNAi 常用的载体有质粒载体和慢病毒载体，相比而言，慢病毒载体有更大的优势，不仅能转染分裂期细胞，又能转染非分裂期细胞，大大提高了转染效率；同时慢病毒载体的稳定性更好，可以容纳大片段的外源基因，并能够长久稳定表达，且免疫反应小，因此，其已经成为理想的转基因载体，应用越来越广泛[17]。

本研究利用RNAi 技术设计了3 条以CRT基因为靶点的siRNA，构建表达CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 质粒，经PCR 阳性鉴定及测序分析证明插入片段的序列及方向均与预期一致，通过转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 筛选出沉默效率最高的CRT siRNA3。将CRT siRNA3包装生产CRT-shRNA慢病毒后，得到高滴度（3.5×107TU/ml）的慢病毒载体Lv-CRT shRNA，完全可以满足后续实验的需求。以人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2 为靶细胞进行慢病毒转染，转染率可达90%，经实时PCR 和West‐ern blot 检测证实，重组慢病毒可以抑制Hep-2 细胞中CRT 蛋白及基因的表达水平，提示本研究成功构建了CRT-shRNA 慢病毒干扰载体，为对以CRT为靶点的基因治疗的进一步研究奠定了基础。