兔血浆应用于部分凝血活酶时间（PTT）试验以评价医疗器械促凝活性的研究

杨文润 莫晓彦 颜林 田胜慧 曹穗兰 杨立峰 广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510080）

内容提要：目的：探究兔血浆应用于PTT试验以评价医疗器械促凝活性的可行性。方法：以ASTM F2382-04标准为研究基础，选择5种医疗器械或材料，在同一试验条件下，分别使用人血浆和兔血浆进行PTT试验。结果：对两种血浆的PTT试验结果进行促凝活性分级，除玻璃珠组的促凝血活性分级有差异外，其他4种医疗器械或材料的促凝活性分级均为：重度、中度、轻度、极轻。结论：兔血浆和人血浆的PTT试验具有良好的一致性，当人血浆来源不足时，兔血浆可作为一种比较理想的血浆来源应用于PTT试验以评价医疗器械的促凝活性。

一般与血液接触的医疗器械都需要进行血液相容性评价，以保证其临床使用的安全[1]。血液相容性评价的凝血试验类分类中推荐评价PTT这个指标[2,3]。由于受限于器械与血液相互作用的认识和其试验的精确度，标准中尚未提供PTT试验的详细方法[1,3]。针对这些情况，本研究对国内外相关的标准、文献进行了大量研究。

PTT是指枸橼酸钠抗凝的血浆进行再钙化试验时加入部分凝血活酶后的凝固时间[1,4]。本研究的PTT试验是基于活化部分凝血活酶时间（APTT）试验的改良，PTT试验中被测材料充当激活剂[5]。ASTM F2382-04中表明其PTT试验的测试方法涵盖、允许评价心血管器械材料通过内源性凝血途径诱导凝血的能力，其测试方法也是医疗器械血液相容性评价的一部分[3,5]。

为了使实验数据具有更好的临床相关性，相关标准均优先推荐使用人血浆进行PTT试验[1,3,5,6]。但目前我国人血浆主要供应于临床输血使用，未经批准的私自采血属于违法行为，检测机构开展大批量的PTT试验时，人血浆很难获得长期、稳定的供应。其次，人血浆可能会携带艾滋、肝炎、流感等传染性病毒，使用前必须经过检验。再加上PTT试验推荐使用的人血浆要求新鲜，要求使用不超过4h的血浆，所以在日常的检验工作中长期大量使用新鲜的人血浆变得极为困难[2,7]。

医疗器械进行血液相容性评价时也常用到家兔、绵羊、狗等实验动物模型[1,3]。相关研究表明，家兔为医疗器械生物学评价中一种常用的动物模型，使用家兔动物模型进行评价医疗器械的血液相容性也较为成熟，因其血液与人的血液有一定的相近之处[4,7]。与人血浆相比，兔血浆更容易获取，兔的品系、供应也更加稳定，健康状况也相对容易控制。基于上述研究和相关文献、标准的理论，此次研究拟使用兔血浆和人血浆进行PTT试验，对兔血浆能否用于PTT试验作进一步探究[1,2,3,5,6,7]。

1.材料与方法

1.1 一般材料

血浆来源：人血浆由3名健康的志愿者提供；兔血浆采集于3只健康、成年普通级家兔（来源：广东省广州市白云区龙归兴科实验动物养殖场，合格证号：SCXK（粤）2017-0042（44817200000186））。

试剂耗材：兔脑磷脂冻干粉（北京博尔西科技有限公司，用纯水配制成兔脑磷脂悬液[3]）、一次性使用真空采血管（江苏康健医疗用品有限公司，管体材质为塑料）、3.8%柠檬酸钠抗凝剂（上海源叶生物科技有限公司）、氯化钙溶液（希森美康生物科技（无锡）有限公司）、鞣花酸（上海源叶生物科技有限公司）、玻璃珠（海门市俊元实验器材）。

仪器设备：全自动血凝分析仪（日本希森美康生物科技有限公司，按ASTM F2382-04的要求设置增加PTT的检测项目）、旋转培养器（太仓市实验设备厂）、去隔水式恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料制备

使用人血浆试验设为A试验，使用兔血浆试验设为B试验。A、B试验各设6组，每组设3个平行管，相同条件制备，将制备好的样品装进一次性使用真空采血管中，具体如下。

组别1：鞣花酸，用纯水配制成10mg/mL悬液，每管加入200μL。

组别2：玻璃珠，直径约2mm，按5cm2/mL比例，每管加入10cm2。

组别3：导丝，制备成约2.0cm的小段，按0.2g/mL比例，每管加入0.4g。

组别4：颅内支撑导管，制备成约2.0cm 的小段，按0.2g/mL比例，每管加入0.4g。

组别5：聚乙烯粒料：直径约5mm，按5cm2/mL比例，每管加入10cm2。

组别6：阴性对照组，不添加任何材料。

1.2.2 血浆制备

新鲜抗凝混合人血浆：通过静脉采血，按血液与抗凝剂9:1的比例加入3.8%柠檬酸钠溶液抗凝，混匀；然后置于高速冷冻离心机中，在2000g条件下离心10min；然后分离出贫血小板血浆（PPP）[4]；最后将3名志愿者的血浆混匀，保存在冰浴中，备用。

新鲜抗凝混合兔血浆：通过心脏采血，同法制备兔血浆。

1.2.3 血浆与材料接触

分别向A试验的所有试管加入2.0mL人血浆，使材料全部被浸没，B试验同法加入兔血浆。将所有试管轻轻混匀后放进隔水式恒温培养箱的旋转培养器上，在（37±1）°C条件下，30r/min动态接触60min。温育结束后将各管中的血浆分离到新的试管中，分离后将所有试管置于冰浴中待测，最后用全自动血凝分析仪分别测定各管血浆的PTT值。

1.2.4 数据分析

根据ASTM F2382-04提供的依据，判断器械或材料对血浆的内源性凝血途径是否有活化作用，需要通过试验组中的NC值进行判定，结果评价标准见表1。

表1.PTT结果评价标准

NC值计算公式：NC(%)=h1/h0

式中：h1为各组的PTT平均值，h0为阴性对照组中的PTT平均值。

2.结果

通过计算得出各组试验结果的平均值（x）、标准差（s）、变异系数（CV）、NC值和促凝活性分级，详见表2和表3。

3.讨论

本研究的试验方法主要参考标准为ASTM F2382-04，同时也进行了改良。血浆在激活过程中，FXII因子的激活是在带负电的表面上或者微生物的膜上发生的一种自激活反应，如玻璃、鞣花酸、高岭土、寅式盐、硫化的右旋糖苷、磷脂等[9,10]。标准推荐使用玻璃珠作为阳性材料，接触表面积为4cm2/mL，加入血浆孵育15min[5]。有研究表明，玻璃珠按5cm2/mL的比例加入血浆孵育30min后，血浆的凝血时间和FⅫ的活化产物更为稳定[8]。为使试验结果重复性和稳定性更好，结合医疗器械生物学评价的加严浸提原则，研究中各种材料与血浆的接触比例增大为5cm2/mL，材料与血浆接触时间从15min延长至60min，血浆均采用新鲜混合血浆以减少个体差异[11]。

表2.A试验结果(人血浆)

表3.B试验结果(兔血浆)

鞣花酸和玻璃珠可作为内源性凝血途径的激活剂，APPT试剂中常添加鞣花酸作为激活剂，所以本研究选择鞣花酸和玻璃珠作为阳性对照材料[5,9,10]。分析表2、3的统计数据，两种血浆试验中鞣花酸组和玻璃珠组的NC值均符合标准中阳性材料的要求（NC值要求小于50%），两种血浆试验中各组的变异系数（CV）均小于15%，且各管PTT值均在本组均值的±25%范围内[5,12]。所以人血浆和兔血浆进行的PTT试验均符合ASTM F2382-04的标准要求，试验体系均成立。

分析表2、3的统计数据，根据ASTM F2382-04促凝活性的分级依据，对两种血浆的试验结果进行促凝活性分级，聚乙烯粒料、颅内支撑导管、导丝、鞣花酸4种医疗器械或材料的促凝活性分级均为：重度、中度、轻度、极轻。虽然玻璃珠组的人血浆和兔血浆的促凝血活性分级有差异，其原因可能是由于部分凝血活酶对不同物种的凝血因子的敏感性存在差异，导致同一材料在同一试验条件下使用不同物种的血浆，其PTT值可能有差异，即使是同一血浆测试不同批次同一物种来源的部分凝血活酶，其PTT值也会产生差异[13]。但玻璃珠组人血浆和兔血浆的NC值阳性材料划分是具有一致性的，均小于50%，且其NC值在各组的阶梯值位置也是具有一致性的。可见不同材料对人血浆和兔血浆的内源性凝血途径的激活作用有良好的一致性。

综上所述，此次研究使用人血浆和兔血浆进行的PTT试验，基于ASTM F2382-04标准要求的同时也有所改进，其结果均符合ASTM F2382-04标准的要求，试验体系成立，试验结果具有良好的一致性。局限于人血的来源和医疗器械产品的复杂性，此次研究的器械或材料和数据还不够全面，如未在此次研究中找到对内源性凝血途径无激活作用的器械或材料。此次研究可为需要长期进行大量日常检验工作提供一个可行性选择，即当人血浆来源不足时，兔血浆可作为一种比较理想的血浆来源，应用于PTT试验以评价医疗器械的促凝活性。