谷胱甘肽-S-转移酶在植物响应冷胁迫方面的研究进展

宋文，单春会，宁明，张琴，周发科，唐凤仙

石河子大学食品学院（石河子 832000）

冷胁迫是限制植物生长、发育以及部分地区经济作物产量的主要非生物因素之一[1]。当植物遭受到低温胁迫时，质膜首先受到伤害，金属离子、代谢物、营养交换及调节细胞过程等生理代谢功能发生紊乱，叶绿体、线粒体膜上的酶活力降低，光合作用和呼吸作用受到抑制，影响相关蛋白质的合成，进而影响植物的正常生长代谢[2-4]。受到冷胁迫的植物体内ROS、MDA、H2O2等聚集积累，含量增加，活性氧的产生与清除动态平衡被打破，致使细胞内的代谢水平失常，从而导致细胞及组织的凋亡，影响植物正常生长[5-8]。为了克服这一障碍，植物在进化过程中产生了各种适应性机制，通过调控相关基因的特异性表达，在植物体内诱导一系列复杂的生理生化变化来应对外界的低温环境，其反应主要包括：诱导Ca2+和ABA的瞬时增加，脂质组成的改变，抗氧化活性的增加和渗透保护剂的积累[9-12]。在抗氧化活性增加的过程中，植物体内活性氧清除系统包括抗氧化酶防御系统和非酶抗氧化防御系统两种自我防护体系[13-14]。其中抗坏血酸（Aseorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（Redueed glutathione，GSH）、类胡萝卜素（Carotenoids，car）等抗氧化剂属于非酶促系统中的主要抗氧化物[15-17]。

谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase，GST，EC2.5.1.18）是一种多功能酶，可以催化还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和疏水、亲电底物的共价结合，形成共轭物，隔离在液泡或转移到质外体，从而对内源和外来有害物质进行降解，以达到降低细胞损害的作用[18-21]。GSTs的功能主要体现在3个方面：（1）催化与自身代谢物的结合反应；（2）结合植物化合物，使其在细胞之间穿梭运输；（3）催化依赖GSH的生物转化反应[22-23]。GST在真核生物和原核生物中普遍存在，国内外有许多学者在植物、动物、真菌和细菌中对其进行了研究。在高等植物中，GST被分为八类，包括Phi（GSTF），Tau（GSTU），Lambda（GSTL），脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR），Theta（GSTT），Zeta（GSTZ），EF1Bγ和四氯氢醌脱卤素酶（TCHQD）[24]。在最近报道的植物GST分类中，新增了蚯蚓血红蛋白和Ⅰ两类[25-28]。在这些亚家族中，Phi，Tau，Lambda和DHAR在植物中特异性表达。典型的GST蛋白含有两个保守的活性位点：一个是N-末端结构域中的GSH结合位点（G-位点），另一个是C-末端共底物结合结构域（H-位点）。G位点特异于GSH并且主要影响催化功能，而H位点有助于特定底物的结合[29-30]。对GST在抵御低温胁迫中的作用进行综述，为进一步研究植物抵御冷胁迫的分子机制提供重要思路。

1 玉米中GST的研究进展

Kósa等[31]对三叶期的玉米幼苗进行0.01% S-甲基蛋氨酸（SMM）处理，室温下培育1 d后转入冷库中。冷胁迫下，经过0.01% S-甲基蛋氨酸（SMM）处理的样品中谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶、愈创木酚过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶活性均高于对照组，而ROS（活性氧）水平低于对照组。结果表明，经过S-甲基蛋氨酸（SMM）处理的玉米幼苗可通过可诱导谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽还原酶及愈创木酚过氧化物酶等酶的大量表达来维持细胞的ROS平衡，增强玉米对冷胁迫的耐受性。

Mahfuzur等[32]将耐冷型玉米BARI hybrid maize-7幼苗培育至两叶期，随后将其置于4 ℃环境中进行培育。与对照组相比，随着应激时间的延长，GST的活性增加，而过氧化氢酶（CAT）的活性相对降低。随后免疫印迹分析（Western blot analysis）表明在冷胁迫期间，GST在幼苗体内显著积累。H2O2含量在冷胁迫初期先增加，随着GST活性的增加，H2O2含量趋于稳定状态，表明GST在耐冷型玉米中的表达可减轻H2O2对玉米细胞结构造成的氧化损伤，维持植物在冷胁迫下的生长。

Gábor等[33]对发芽期的玉米（Zea maysL.）进行羟胺衍生物BRX-156处理，随后置于低温环境中（5℃）培育一周。待样品生长至三叶期后通过复合胁迫活力试验（CSVT）确定幼苗中BRX-156对冷胁迫耐受性最大时的有效浓度。结果表明，与未经处理的样本相比，玉米中的谷胱甘肽还原酶在50 mg·L−1BRX-156的诱导下活性增加了150%，幼苗的根、茎、鲜重分别高于对照组，表明经过BRX-156处理的玉米可通过诱导GST的大量表达，从而提高植物的抗寒性。

2 薯类GST的研究进展

Liu等[34]取生长旺盛的甘薯（Ipomoea batatsL.）植株的茎尖或尚未分化的腋芽，经消毒后，切成段，接种到琼脂含量为1.8%的MS培养基上培养，培养温度为27±2 ℃，光照约2 000 Lux。待无菌苗生长到约3 cm高时，选取生长旺盛的健康无菌苗，置于4 ℃冰箱，低温诱导24 h后提取总RNA，同时提取常温生长对照组的总RNA，随后利用RT-PCR扩增IBGSTU1基因的编码区片段，并对产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。Western blotting的分析结果显示，经过冷胁迫，甘薯组织在蛋白质水平上也能检测到IBGSTU1基因的表达，说明甘薯IBGSTU1基因是诱导型表达，并且具有组织表达差异性，冷胁迫能够在转录和翻译水平上诱导IBGSTU1的响应，协助保护组织免受伤害。

Seppänen等[35]从耐冷型的马铃薯S.commersonii中克隆并鉴定了一种新型低温调节GST——Solanum commersonii谷胱甘肽S-转移酶（Scgst1），并在转录组学水平研究了Scgst1的耐冷机制。在经过过氧化氢和水杨酸处理的样品中检测到较强的mRNA信号，因此得出结论：Scgst1与早期活性氧物质（AOS）的调节相关。随后在快速形成AOS的试验条件下发现Scgst1在S.commersonii中显著积累。在同一条件下，尽管在不耐冷型S.tuberosum中发现了Scgst1序列，然而并没有检测到Scgst1的积累。推断：相比于不耐冷型的S.tuberosum，耐冷型的S.commersonii中Scgst1的大量积累与表达可以降低低温对马铃薯细胞的损害，从而提高S.commersonii品种的耐冷性。

在后续研究中，Seppänen等[36]在低温下对不耐冷型的S.tuberosum与耐冷型的S.commersonii中的glutathione S-transferase（ScgstF1）、heat shock cognate 70 kDa（Schsc70）以及dehydrin2（Scdnh2）等耐冷因子进行深入研究。荧光定量试验结果（q-PCR）显示S.commersonii和S.tuberosum的光合作用在霜冻期间均有所下降，而在S.tuberosum中，光合作用的下降程度更大并且表现为不可逆型。与此同时，相比于S.tuberosum，在S.commersonii中检测到ScgstF1和Scdhn2的大量积累。进一步发现，在经过冷驯化和H2O2处理的样本中，ScgstF1和Scdhn2在S.commersonii中均有大量积累，而在S.tuberosum中，只有Schsc70有所积累。结果表明，ScgstF1等耐冷因子可通过影响马铃薯的光合作用从而改变其耐冷性，H2O2预处理对ScgstF1等耐冷因子的表达与积累有积极作用。

3 水稻中GST的研究进展

作为人类的主要粮食作物，水稻在自然环境下容易受到冷胁迫的侵袭。为了解水稻对冷胁迫的响应机制，Zhao等[37]对耐寒型丽江新源河谷粳稻品种（LTH）进行低温（8 ℃）处理，随后进行全基因组表达分析，分别选取6，12，24和48 h四个时间点的样品进行RNA提取及生信分析。qRT-PCR分析结果显示，在抗氧化酶基因中发现了19种谷胱甘肽S-转移酶（GST），其中有14种GST基因上调表达。在响应冷胁迫期间，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因（Os04g0556300）也有类似的特异性表达，这表明谷胱甘肽酶可以作为LTH中的活性氧物质（ROS）清除剂。

Takesawa等[38]从玉米中提取了zeta-glutathione-S-transferase基因，随后通过土壤杆菌（Agrobacterium）将其导入到87株水稻中。在后期验证试验中，转基因品系的幼苗在低温胁迫下表现出较强的萌发和生长速率。结果表明，低温胁迫下，转zeta-glutathione-S-transferase植物GST活性的增强可能调节与冷胁迫相关基因的表达以降低活性氧水平，增强植物耐低温能力，提高植物的存活率。

Wang等[39]培育了野生型（对照组）、OsSPX1转基因系植株与反OsSPX1转基因系植株，并发现OsSPX1表达的下调与水稻幼苗对冷胁迫的高度敏感性密切相关。在冷胁迫下，与野生型和OsSPX1转基因株系相比，反OsSPX1基因株系幼苗叶片中积累了大量的过氧化氢。水稻全基因组GeneChip分析显示，OsSPX1可通过促进谷胱甘肽S-转移酶、P450s等氧化应激标记基因以及Pi-信号传导途径及相关基因（OsPHO2）的上调表达，从而提高转基因株系的耐冷性。

目前GST中有关Lambda家族蛋白的相关研究较少，Kumar等[40]研究发现，水稻中OsGSTL2属于GST中Lambda类成员，在抵御冷胁迫方面有积极作用。随后将OsGSTL2导入到拟南芥中在不同胁迫条件下培养，分析表明OsGSTL2对冷胁迫和其他非生物胁迫（如重金属、渗透胁迫和盐）具有耐受性，与野生型相比，转基因系植株的发芽率、根长、GST活性更高。结果表明，OsGSTL2通过增强拟南芥体内的抗氧化系统从而提高植物对冷胁迫的耐受能力。

4 其他植物中GST的研究进展

南瓜（Cucurbita maxima）营养丰富，是一种重要的经济作物，然而低温会影响它们的生长，严重影响其产量。Abdul等[41]将耐冷型的C.maxima（CP-1）和冷敏感型的C.moschata（EP-1）南瓜幼苗分别置于5，10和15 ℃环境中进行培养，在0，6，24，48和72 h五个时间点对样品的叶片进行RNA提取，同时对根部、茎、花朵进行采样，后期用作器官特异性表达分析。分析结果显示，在冷胁迫下总共鉴定到32个GST基因，所有CmaGST基因在CP-1（C.maxima）和EP-1（Cucurbita moschata）中均特异性表达，其中7个（CmaGSTU3，CmaGSTU7，CmaGSTU8，CmaGSTU9，CmaGSTU11，CmaGSTU12和CmaGSTU14）在CP-1中均上调表达，其中18个CmaGST属于tau类。在CP-1的20条染色体中，CmaGSTs分别在其中13条上有所表达，4号和6号染色体上的数量最多。CmaGST的上调表达缓解了冷胁迫对细胞的损伤，表明南瓜CmaGST在抵御冷胁迫过程中发挥着重要意义。

Yang等[42]研究了核桃（J.regia）中的tau亚家族谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因JrGSTTau1（Gene Bank No.：KT351091）。分别在16，12，10，8和6 ℃的条件下，发现JrGSTTau1在样品中被应激诱导。与野生型prokII（空载体对照）相比，瞬时转化表明JrGSTTau1的核桃中GST、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）表达量较高，而过氧化物酶（POD）活性、H2O2、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）和电解质流失率（EL）相对较低。为了进一步证实JrGSTTau1的作用，将JrGSTTau1导入烟草中进行异源表达，分别选择转基因系Line5，Line9和Line12进行分析。结果表明常温下野生型植株，Line5，Line9和Line12的萌发状态相似，但在冷胁迫下，转基因株系的鲜重、初生根长和总叶绿素含量显著高于野生型植株。在后期培养过程中，转基因烟草的GST和SOD活性显著高于野生型。

马建辉等[43]研究发现，在低温胁迫下，AEGTA19581、AEGTA27563、AEGTA27835、AEGTA32578和AEGTA07316在山羊草（Aegilops tanschii）的根中显著上调表达，而AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA32578和AEGTA07316在叶中也显著上调表达，这表明GST基因在响应低温胁迫时，可能同时在根和叶中发挥着调控作用。

有研究表明花青素在植物响应冷胁迫过程中具有调节作用，在此过程中，GST起到了运输花青素的作用[44-45]。Carmona等[46]在Pa与Ma两种血橙（C.sinensisL. Osbeck）4 ℃与9 ℃的低温贮藏分别发现了8与4个GST，它们属于Phi与Tau类。与4 ℃相比，GST-F12、GST-F9、GST-F6、GST-U1在9 ℃的条件下上调表达，与花青素的浓度表达趋势一致，花青素含量越高，血橙耐冷性越好。结果表明，GST通过参与花青素的转运从而调节血橙的耐冷性。

5 结语与展望

低温胁迫是限制植物生长的主要环境因素之一[47-51]。在受到冷胁迫侵袭时，植物体内会积累大量的ROS、MDA、H2O2等物质，这些物质的积累会破坏植物细胞中各种细胞器、蛋白质等生物分子，破坏膜的完整性和功能，影响植物的正常代谢[52-53]。植物自身在抵御胁迫的过程中，酶促防御系统中GST可将GSH与H2O2催化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O，也可将有机氢过氧化物分解为醇类、水和GSSG，GSSG随后被谷胱甘肽还原酶还原为GSH，然后通过GSH与过氧化物反应，减少低温胁迫对细胞膜结构的损伤[54-55]。

之前的研究证实GST在抵御冷胁迫及其他非生物胁迫方面扮演着重要的角色[56-59]。然而，在抵抗冷胁迫过程中植物GST的调节功能还是未知的，冷胁迫条件下GST是如何参与初级和次级代谢以及细胞信号传导和调节功能、不同种类GST是如何发挥各自的作用、GST种类的差异性是否会对调节作用有影响以及这些GST具体是如何调控基因的表达及其与其它蛋白之间的关系等都有待于深入研究。在实际应用方面，现在主要通过基因工程技术将GST相关基因导入目的作物，培育出新型高产抗逆品种，用于对冷胁迫及其他胁迫具有增强抗性的转基因作物的开发。但是当前转基因技术还处于发展阶段，其研究的安全性、转基因相关的事例都还缺乏同时符合权威、科学、可信标准的渠道来解读[60-61]。尽管植物抗胁迫基因工程的研究已经取得了很多方面的进展，但是抗胁迫转基因植物作为转基因植物的一种，也会引发人们对其安全性的思考[62]。因此在未来的研究中，如何更加多元化、安全快捷地将GST应用于作物抗逆性的研发将变得非常有必要。随着转录组学、蛋白质组学等研究方法的不断发展，GST在冷胁迫条件下的调节功能和分子机制将得到进一步的研究，在农业生产过程中的实际应用也将得到发展，这也将对作物在冷胁迫下提高其耐冷性有重要意义。