应用多重Digoxigenin标记探针在核酸斑点杂交检测中识别Ⅰ群禽腺病毒的感染

侯力丹，张亚文，苏 奇，刘 丹，毛娅卿，王 嘉，黄小洁，赵 鹏*，李俊平*，杨汉春

(1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.中国农业大学 动物医学学院，北京 100193；3.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，可分为3个群，其中I群FAdV致病力和影响最大，Ⅰ群FAdV具有共同的群抗原，可分为A～E共5个种，12个血清型(FAdV1-8a，8b-FAdV11)[1]，并可引起鸡的包涵体肝炎 (IBH)、心包积液综合征(HPS) 和肌胃糜烂 (GE) 等病症[2-3]。自2015年6月以来，我国山东、河南、河北等省份的部分地区鸡群中发生了以心包积液和肝脏肿大为特征的传染病，将该病称为鸡心包积液-肝炎综合征[4-6]。经过大量的研究，确定该病是由血清4型的Ⅰ群FAdV所引起[7]，近期也报道了血清4型的Ⅰ群FAdV在水禽中的感染[8]。

尽管血清4型的Ⅰ群FAdV是临床上报道最多的流行血清型，但是仍然有其他血清型Ⅰ群FAdV也会不断被检出。早在1998年就曾有报道指出，通过一对通用引物可以同时检测出Ⅰ群FAdV所有的血清型[9]。相对于引物识别的特异性，由Digoxigenin标记的病毒核酸探针识别靶基因的特异性更高，本研究试图开发出可以同时检测I群FAdV所有12种血清型的Digoxigenin标记核酸探针。为此本研究对Ⅰ群FAdV的12种血清型参考毒株对应的单一Digoxigenin标记核酸探针及其混合后的多重探针用于同时检测Ⅰ群FAdV时的灵敏度和特异性进行了系统比较，建立了应用多重Digoxigenin标记核酸探针组合在核酸斑点杂交检测中识别Ⅰ群FAdV感染的新方法。

1 材料与方法

1.1 病毒毒株及其增殖A亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup A，ALV-A)SDAU-14A1株(KU375453)、J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)NX0101株(DQ115805)、禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)HA9901株(AY84-2951)均由山东农业大学家禽肿瘤病研究室分离鉴定和完成基因组测序，上述毒株接种DF-1细胞增殖后按照Reed- Muench法测定其TCID50后冻存于-80℃备用。鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)SDLY08株(FJ172347)由山东农业大学家禽肿瘤病研究室分离鉴定和完成基因组测序，接种SPF鸡胚后按照Reed-Muench法测定其EID50后冻存于-80℃ 备用。Ⅰ群FAdV的12个血清型参考毒株由中国兽医药品监察所鉴定和保存，各毒株的具体信息见表1，12个血清型参考毒株接种LMH细胞后按照Reed-Muench法测定其TCID50。

表1 Ⅰ群FAdV的12种血清型参考毒株GenBank登录信息

1.2 引物的设计与合成参考表1所列12种血清型参考毒株的基因序列，根据其相互之间的同源性，针对不同毒株之间相对保守的hexon基因区域，用Premier 5.0设计了用于扩增和合成12种不同血清型参考毒株Digoxigenin标记探针所需的引物。根据部分毒株之间的同源性，某些探针引物可用于同时扩增多个参考毒株，如血清3型和血清9型参考毒株引物相同，血清4型和血清10型参考毒株引物相同，血清6型、血清7型和血清8型参考毒株引物相同，血清2型和血清11型参考毒株引物相同。不同引物的序列及其对应的不同参考毒株核酸位点参见表2。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 Digoxigenin标记核酸探针的制备与纯化分别以表1所列12种血清型参考毒株的病毒DNA为模板，利用表2所列引物进行PCR扩增，扩增体系为50 μL，其中ddH2O 36.5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，rTaq 0.51 μL，模板1 μL。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行回收，以OMEGA核酸凝胶回收纯化试剂盒进行纯化，纯化后的PCR产物连接至pMD18-T载体上,选取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序和验证。以测序验证后的12种血清型参考毒株对应hexon基因质粒为模板，参照罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书，利用表2所列引物经PCR合成不同参考毒株的Digoxigenin标记探针。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行回收，以OMEGA公司核酸凝胶回收纯化试剂盒进行纯化并定量，定量后的探针冻存于-80℃备用。将所有探针混合组成的组合探针标记为探针PM。

表2 针对hexon基因用于扩增Ⅰ群FAdV的探针所需引物序列

1.4 不同探针用于不同参考毒株的斑点杂交检测分别将Ⅰ群FAdV的12种血清型参考毒株完整hexon基因PCR扩增产物依次点样于尼龙膜上，同时将ALV-A的SDAU14A1株、ALV-J的NX0101株、REV的HA9901株和CIAV的SDLY08株感染DF-1细胞或SPF鸡胚后的总DNA点样于尼龙膜上作为其他病毒对照，同样的尼龙膜制备13张，分别与12个探针和混合探针PM按照常规方法进行核酸斑点杂交检测。每个点样处滴加同一血清型参考毒株完整的hexon基因PCR扩增产物有效核酸含量分别为500,300,100,50,10 pg等5个不同稀释度。如表3所示，杂交膜第1行前1～5个加样点分别为500,300,100,50,10 pg的参考毒株A1完整hexon基因PCR扩增产物，以此类推。

表3 每张尼龙膜上滴加12个血清型参考毒株hexon基因PCR扩增产物与其他病毒顺序及其核酸量 pg

2 结果

2.1 12个血清型参考毒株对应Digoxigenin标记核酸探针的制备分别以表1所列12种血清型参考毒株的病毒DNA为模板，利用表2所列引物进行PCR扩增，纯化后的PCR产物连接至pMD18-T载体上,选取阳性克隆经上海生工生物工程有限公司进行测序，序列比对显示所测序列与各毒株发表序列高度一致，证实设计合成引物具有高度的特异性。以测序验证后的各血清型参考毒株hexon基因质粒为模板，以罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit合成了12种血清型参考毒株对应的Digoxigenin标记核酸探针，经电泳鉴定(图1)，因为合成的探针上标记Digoxigenin后相对分子质量显著增大，各血清型参考毒株合成后的探针相对于同样引物扩增的未标记的常规PCR产物在电泳中呈现明显滞后。用于检测12种血清型参考毒株的Digoxigenin标记核酸探针定量后组成了组合探针PM。

图1 12种血清型参考毒株对应Digoxigenin标记核酸探针的电泳鉴定 每种血清型参考毒株对应探针标记前的DNA片段和标记后的DNA片段分别以1和2标识， -1是以参考毒株的病毒DNA为模板，利用表2所列对应引物进行常规PCR扩增得到的电泳图条带； -2是以参考毒株的病毒DNA为模板，利用表2所列对应引物以罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit扩增得到的Digoxigenin标记核酸探针电泳图条带;M.DL2000 DNA Marker

2.2 12个血清型Digoxigenin标记核酸探针与各毒株杂交结果如图2和表4所示，A1探针可以识别出50 pg的A1对应hexon基因PCR纯化产物，但不识别其他毒株的hexon基因PCR纯化产物，显示该探针相对于其自身对应核酸具有较高的识别能力和灵敏度。而B5探针可以识别出B5，E6，E7，E8a，E8b等不同血清型参考毒株的对应hexon基因PCR纯化产物，但识别强度有较大差异，如B5探针可以识别出50 pg的B5和E8b 2个毒株对应hexon基因PCR纯化产物，识别100 pg的B6毒株对应hexon基因PCR纯化产物，而识别E7和E8a 2个毒株对应Hexon基因PCR纯化产物仅仅达到300 pg。在12种单一Digoxigenin标记核酸探针中，没有任何一个能够同时识别出所有Ⅰ群FAdV的12个血清型参考毒株核酸。

2.3 应用多重组合探针与12种血清型参考毒株的杂交结果如图3和表5所示，应用所有探针混合组成的多重探针PM分别与Ⅰ群FAdV的12种血清型参考毒株同时杂交时显示出两大优势，一是多重探针可以与Ⅰ群FAdV的12种血清型参考毒株均发生明显的杂交反应并且显色更加明显，显示该方式可实现用于同时检测Ⅰ群FAdV的目的；二是多重探针显示出较高的灵敏度优势，多重探针可有效识别A1等7个血清型参考毒株10 pg的有效核酸，对C4等其他型参考毒株也可以识别出10～50 pg 的有效核酸，这是在单独使用某一探针时都难以达到的灵敏度。

表4 12 个血清型对应单一核酸探针分别与12 个血清型毒株同时杂交的检测灵敏度比较 pg

图2 12个血清型对应的单一核酸探针分别与12种血清型毒株同时杂交的检测结果

表5 多重探针PM与12个血清型毒株杂交的检测灵敏度比较 pg

图3 多重探针PM与12个血清型毒株同时杂交的检测结果

3 讨论

目前检测FAdV的方法有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验和中和试验等[1，10]，这些方法具有操作繁琐和耗时长等缺点。限制性核酸内切酶技术(REA)、PCR和荧光定量PCR等分子检测技术都可用于检测FAdV[11-13]。近期，有报道利用更为灵敏的微滴式数字PCR(ddPCR)技术检测禽弱毒疫苗中微量的4型FAdV[14]。

目前针对FAdV的核酸检测选择靶基因区域主要集中于其hexon基因，Hexon是FAdV的主要表面抗原蛋白，含有型、型间特异性抗原表位及中和性抗原表位，可以刺激机体产生抗体，抑制病毒构象的改变，从而中和病毒。此外，hexon基因在FAdV各毒株中相对保守[15]，因此本研究仍旧选择hexon基因作为检测靶基因。

不管是常规的PCR、荧光定量PCR还是更为灵敏的微滴式数字PCR，其检测的特异性均首先基于引物的可靠性，依赖较短的引物所建立的PCR扩增一般需要经过测序做进一步的验证，这无疑又延长了检测时间。常规的PCR可以选取扩增长度较长的基因区域进行扩增，引物可选择的基因长度范围相对放宽，但荧光定量PCR和微滴式数字PCR不适宜选取扩增长度较长的基因区域进行扩增，而这恰恰是面对Ⅰ群FAdV的12个血清型现实不得不考虑的困难，在较短的区域内选择可以同时准确而稳定的检测Ⅰ群FAdV的12个血清型毒株存在较大的风险。相对于上述方法，核酸探针斑点杂交技术是基于标记探针进行配对的技术，核酸探针的长度一般要数百个bp甚至1 000 bp以上，这显著增加了核酸探针配对的可靠性和稳定性。为此本研究试图探索不同血清型探针用于同时检测Ⅰ群FAdV的可行性并首次提出使用多重核酸探针进行杂交检测的可行性。

尽管12个血清型的毒株均属于Ⅰ群FAdV，并且选择了FAdV中相对保守的hexon基因设计合成探针，但是结果和序列分析预测的一样，没有哪一种血清型毒株所对应的核酸探针可以同时识别Ⅰ群FAdV的12个血清型毒株，不同的探针单一进行杂交时识别的血清型毒株及其灵敏度均有较大的差异，如最好的以E8b毒株核酸所标记的核酸探针可以同时识别Ⅰ群FAdV的8个血清型毒株，并且针对同血清型毒株可以识别最低浓度的核酸，但是在检测中仍然面临对其他4个血清型毒株漏检的风险。相对于单一核酸探针，应用所有探针混合组成的多重探针PM无论是识别毒株的广泛性还是检测的灵敏度均体现出非常显著的优势，这和本试验预测的结果是一致的。这也提示，当某种病毒存在基因相对同源但是又存在较大的差异时，可以考虑应用含有不同探针组合的方式来减少漏检。

本研究建立了应用多重Digoxigenin标记探针在核酸斑点杂交检测中识别Ⅰ群FAdV核酸的新方法，为解决类似病毒高通量检测提供了新的思路。