甲状腺肿瘤患者PCDH8基因启动子的甲基化状态及其临床意义▲

朱明章 梁伟新 赖勇强 彭和平 黄尚书 冯伟兆 谷小玉 李林株 李志宏

(广东省佛山市高明区人民医院1 普外科，3 病理科，佛山市 528500,电子邮箱：358767716@qq.com；2 广州医科大学附属第二医院普外科，广东省广州市 510260)

甲状腺癌是头颈部和内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%，近年来其发病率呈上升趋势[1]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲状腺癌最常见的病理类型，发病率高，生长缓慢，预后较好，但易发生早期淋巴结转移及术后复发[2]。研究发现，多种基因DNA甲基化与甲状腺肿瘤的发生发展密切相关[3-8]。原钙黏蛋白8(protocadherin 8，PCDH8)是钙黏附蛋白家族中的一员，在细胞黏附、增殖、分化和迁移中起着重要的作用[9]。已有研究证实PCDH8基因为一个候选的抑癌基因，其通过突变或启动子甲基化在多种癌症中失活，包括乳腺癌、袖套淋巴细胞瘤、结直肠癌、肾细胞癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌等[10-19]。但目前关于PCDH8基因甲基化与甲状腺肿瘤关系的研究仍鲜有报道。本研究检测甲状腺肿瘤和正常组织中PCDH8基因启动子的甲基化状态及蛋白表达水平，探讨PCDH8基因启动子甲基化与PTC临床病理特征的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2013年6月至2016年12月期间在佛山市高明区人民医院经手术切除甲状腺组织的180例患者作为研究对象，其中PTC48例、甲状腺滤泡状腺瘤43例、结节性甲状腺肿44例和正常甲状腺组织45例，所有患者均经病理检查确诊，患者术前均未行放化疗。纳入标准：(1)PTC、甲状腺腺瘤及结节性甲状腺肿均符合2012年《中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》；(2)年龄18～65岁；(3)入组前未接受放化疗等治疗。排除标准：(1)有其他恶性肿瘤病史或合并其他恶性肿瘤者；(2)合并其他严重基础疾病者。本研究已通过佛山市高明区人民医院医学伦理委员会审查，且获得所有研究对象知情同意。

1.2 试剂及引物 DNA提取试剂盒购自上海基因科技公司(批号：2018111401)，亚硫酸氢盐修饰及纯化试剂盒购自德国Qiagen公司(批号：20170531)，焦磷酸测序试剂盒(PyroMark Gold Q96 Reagents)购自德国Qiagen公司(批号：154037384)，免疫组化一抗人抗鼠PCDH8抗体购自美国SANTA CRUZ公司(批号：L-20170113)，二抗羊抗鼠IgG抗体购自美国BIOWORLD公司(批号：BS12471)，甲基化基因测序试剂盒购自德国Qiagen公司(批号：157025148)，DAB显色液购自杭州协博医药公司(批号：20024970)；所有引物设计均采用Primer 5软件设计，由上海英潍捷基公司合成并进行预实验验证。

1.3 焦磷酸测序检测标本DNA甲基化 按试剂盒说明书步骤提取标本DNA，使用亚硫酸氢盐修饰及纯化试剂盒对提取好的组织DNA进行亚硫酸氢盐修饰及纯化，于-20℃保存备用。基因PCR扩增，亚硫酸轻盐处理后测序，上游引物：5′-ATTAAAGGGATTGTTAGAGGTAGG-3′， 下游引物：5′-CTCATACCTCCAACCTCAAATAC-3′(5′端生物素标记)。按照下列反应条件进行扩增：95℃预变性2 min；95℃ 25 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃延伸10 min。反应产物采用2%琼脂糖凝胶电泳确认目的条带。甲基化基因测序：制备含生物素标记DNA单链，按照PyroMark ID遗传分析系统和试剂盒说明书，用序列分析和单核苷酸多态性模式进行测序位点分析。检测位点：PCDH8基因启动子，NCBI Reference Sequence：NC_000013.11(chromosome 13,GRCh38.p7，52848593-52848604)。检测序列：CGGGTCCGCGCG。4个位点任意一个出现C，且测序比例大于20%，则表示发生甲基化；相反，4个位点C的测序比例均小于20%，则表示未甲基化。

1.4 免疫组化法检测PCDH8蛋白表达 对石蜡包埋的甲状腺标本进行厚度为5 μm的连续切片，标记、分类及晾干后放入60℃烤箱中烤片1 h。脱蜡后用pH=7.3的10 mM磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3次，5 min/次；使用3% H2O2浸泡标本15 min，微波炉低火阻断内源性过氧化物酶5 min，再使用10 mmol/L柠檬酸钠浸泡，高温高压(100℃～120℃，80～90 kPa)进行抗原修复，冷却后采用PBS缓冲液冲洗3次，5 min/次，加入PCDH8一抗(1 ∶100)4℃孵育过夜。次日，采用PBS缓冲液冲洗切片3次，5 min/次，滴入二抗IgG(1 ∶200)，37℃孵育40 min，PBS缓冲液再冲洗3次，5min/次，滴加DAB显色液显色3～5 min。水洗终止显色，苏木素染细胞核15 s，水洗、蓝化、脱水、透明、封片。奥林巴斯CX31显微镜下观察并照相。根据细胞显色深浅记分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分， 0～2分判断为PCDH8表达阴性，≥3分判断为PCDH8表达阳性。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计数资料以例数(百分比)表示，多组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；焦磷酸测序甲基化率和免疫组化基因表达调控率比较采用McNemar检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组甲状腺标本PCDH8基因启动子甲基化及蛋白表达情况的比较 4组甲状腺组织的PCDH8基因启动子甲基化焦磷酸测序及蛋白表达情况比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中PTC的PCDH8基因启动子甲基化率高于正常甲状腺组织，PCDH8基因蛋白表达阳性率低于正常甲状腺组织(均P<0.05)，而其他3组的上述指标，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组甲状腺组织PCDH8基因启动子甲基化及蛋白表达情况的比较[n(%)]

2.2 PCDH8基因启动子甲基化和蛋白表达调控的相关性 正常甲状腺组织PCDH8蛋白表达阳性的24例标本中，PCDH8基因未发生甲基化为20例，重合率为83.33%。甲状腺癌标本PCDH8蛋白表达阴性的37例标本中，有33例发生PCDH8基因启动子甲基化，重合率为89.18%。对两种检测方法结果进行McNemar检验，焦磷酸测序和免疫组化检测结果一致并无明显差异(P=1.000)，说明基因启动子甲基化和蛋白表达阴性存在一定相关性。

2.3 PTC患者PCDH8基因启动子甲基化与其临床病理特征的相关性 PTC患者PCDH8基因启动子甲基化与淋巴结转移有关联性(P<0.05)，而与其年龄、性别、术前促甲状腺激素水平、抗甲状腺球蛋白抗体水平及肿瘤部位无明显关系(均P>0.05)。见表2。

表2 PTC患者PCDH8基因启动 子甲基化与其临床病理特征的相关性(n)

3 讨 论

抑癌基因失活是肿瘤发生发展的一个重要分子生物学事件。有研究证实，遗传学和表观遗传学机制都可能导致抑癌基因失活[20-22]。研究表明，抑癌基因的高甲基化是肿瘤发生发展的特征之一，并可作为诊断和预后评估的生物标志物[20-21]。因此，抑癌基因的高甲基化水平在肿瘤的诊断、预后评估和基因靶向治疗方面具有广大前景。钙黏蛋白被认为在癌症的发生发展过程中起构建和维持组织结构的关键作用[22-25]。钙黏蛋白家族分为经典钙黏蛋白、桥粒钙黏蛋白和原钙黏蛋白。原钙黏蛋白是钙黏附蛋白超家族中最大的亚群，钙黏附家族基因的异常启动子甲基化被发现与多种癌症的发生密切相关[10,26-28]。PCDH8是原钙黏蛋白家族成员之一，已有研究发现其在不同的肿瘤基因中发生异常甲基化，导致PCDH8基因发生突变或表观遗传性沉默，而外源性表达PCDH8基因可抑制肿瘤细胞的增殖和转移，具有抑癌基因的作用[10-19]。

本研究观察甲状腺肿瘤中PCDH8基因DNA启动子甲基化状态及基因蛋白表达情况，结果显示，PTC的PCDH8基因启动子甲基化率高于正常甲状腺组织，PCDH8基因蛋白表达阳性率低于正常甲状腺组织(均P<0.05)，而甲状腺滤泡状腺瘤、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织的PCDH8基因启动子甲基化率和蛋白表达阳性率差异均无统计学意义(均P>0.05)，且PTC的PCDH8蛋白表达阴性率高达77.08%，PCDH8基因甲基化率高达81.25%，这表明与正常甲状腺组织相比，PCDH8基因启动子甲基化在PTC中更为常见。结合PCDH8基因的甲基化状态和蛋白表达情况，本研究分析发现PCDH8基因发生甲基化与基因蛋白表达缺失在PTC的重合率为89.18%，这表明PCDH8基因甲基化与蛋白表达调控具有一定的关联性，与国内外相关研究报道[10,15,17,19]的结果相符合。此外，有研究发现PCDH8基因甲基化与肿瘤患者的甲胎蛋白水平、预后、复发、转移、肿瘤大小、组织形态、临床分期和病理分级等具有相关性[17-19]。本研究结果显示，PTC患者的PCDH8基因启动子甲基化与淋巴结转移相关(P<0.05)，而与其年龄、性别、促甲状腺激素水平、抗甲状腺球蛋白抗体水平及肿瘤部位无明显关系(P>0.05)。这可能与抑癌基因的甲基化失活，其内在黏附、迁移、增殖功能改变，促进肿瘤的转移侵袭有关。

综上所述，PTC患者中的PCDH8基因启动子甲基化率高，PCDH8蛋白表达水平低，PCDH8基因甲基化与蛋白表达调控具有一定的关联性，且PCDH8基因启动子甲基化与PTC患者的淋巴结转移有相关性，或可作为甲状腺肿瘤诊断和预后评估的一个潜在生物标志物。