超声结合聚乙二醇化多西他赛白蛋白纳米粒治疗裸鼠非小细胞肺癌模型疗效观察

阴美娇 金香子 Amit Sinha 金光明

[摘要] 目的 利用超声结合聚乙二醇化多西他赛白蛋白纳米粒（PEG-DANPs）治疗裸鼠非小细胞肺癌模型，为临床治疗人非小细胞肺癌提供一种新思路。 方法 建立BALB/c裸鼠人非小细胞肺癌皮下移植瘤及原位癌模型，分别用多西他赛白蛋白纳米粒（DANPs）、PEG-DANPs及PEG-DANPs结合超声波（US）照射对两组裸鼠进行治疗，单次疗程为7 d，共4个疗程，超声波辐照强度为1 MHz，每次时长30 s。全部疗程给药结束2 d后，将全部造模裸鼠处死，取皮下组瘤块进行TUNEL实验观察癌细胞凋亡情况，对原位癌组裸鼠的肺及肝组织进行HE染色病理实验及病理半定量分析。 结果 与其他给药组相比，US+PEG-DANPs组裸鼠瘤块体积最小（P<0.05，P<0.01）;同时其体重保持最好，提示其毒性最小（P<0.05）。从NSCLC原位癌裸鼠肺组织和肝组织病理图来看，US+PEG-DANPs抑制原位癌、抗转移作用最为明显;对其肺组织和肝组织病理图进行半定量分析，差异有统计学意义（P<0.05）。根据TUNEL 法检测结果，US+PEG-DANPs组诱导癌细胞凋亡的能力最强。 结论 超声波结合PEG-DANPs对裸鼠非小细胞肺癌模型的治疗效果明显，有望成为治疗非小细胞肺癌的一种新选择。

[关键词] 非小细胞肺癌;超声波;多西他赛;白蛋白纳米粒;聚乙二醇

[中图分类号] R944          [文献标识码] A          [文章編号] 1673-9701（2020）33-0043-05

[Abstract] Objective To treat non-small cell lung cancer model in nude mice by ultrasound combined with docetaxel loaded PEG-albumin nanoparticles（PEG-DANPs），so as to provide a new idea for clinical treatment of human non-small cell lung cancer. Methods The models of subcutaneous transplanted tumor and carcinoma in-situ of human non-small cell lung cancer in BALB/c nude mice were established. Docetaxel loaded albumin nanoparticles（DANPs），PEG-DANPs and PEG-DANPs combined with ultrasound（US） were used to treat the two groups of nude mice，with a single course of treatment of 7 days and a total of 4 courses of treatment. The intensity of ultrasound irradiation was 1 MHz and the duration of each time was 30 s. Two days after the administration of the whole course of treatment， all the nude mice were sacrificed， and the tumor mass of the subcutaneous group was taken for TUNEL test to observe the apoptosis of cancer cells. The lung and liver tissues of nude mice of the in-situ cancer group were subjected to pathological experiment of HE staining and semi-quantitative pathological analysis. Results Compared with other groups，the tumor volume of nude mice in the US combined with PEG-DANPs group was the smallest（P<0.05，P<0.01）. At the same time，its weight kept the best，suggesting that its toxicity was the smallest（P<0.05）. From the pathological images of lung tissue and liver tissue of nude mice with NSCLC carcinoma in-situ，US combined with PEG-DANPS have the most obvious efficacy on inhibiting carcinoma in-situ and resisting metastasis. Semi-quantitative analysis was given to the pathological images of lung and liver，and the difference was statistically significant（P<0.05）. According to TUNEL method，the ability of inducing apoptosis of cancer cells in the US combined with PEG-DANPs group was the strongest. Conclusion Ultrasound combined with PEG-DANPs have obvious therapeutic efficacy on non-small cell lung cancer model in nude mice，which is expected to be a new choice for the treatment of non-small cell lung cancer.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Ultrasonic wave; Docetaxel; Albumin nanoparticles; Polyethylene glycol

非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）在所有肺癌的分型中最为常见，占肺癌总数的75%以上[1]，其5年总生存率不足15%[2]，严重危害人类健康。通过本课题组前期研究发现，聚乙二醇化多西他赛白蛋白纳米粒（Docetaxel loaded PEG-albumin nanoparticles，PEG-DANPs）可有效抑制NSCLC的生长和转移，然而，如何进一步提升纳米粒的靶向性及疗效仍是我课题组需要研究的方向。

超声波（Ultrasound，US）是指高于20 000 Hz的声波，特点是方向性好、穿透能力强、声能集中，在医学、军事、工业、农业各领域中应用广泛。国外研究[3]表明，超声波可以提升纳米抗癌药的治疗效果，其主要作用机制为超声波的一些物理效应，如空化及弥散作用。

本研究将建立BALB/c裸鼠NSCLC皮下移植瘤及原位癌模型，利用US结合PEG-DANPs对上述模型进行治疗，旨在进一步提升纳米制剂靶向性，同时阐明超声波作用的机制，为治疗NSCLC提供一种新方法。

1 材料與方法

1.1 动物和细胞株

人非小细胞肺癌A549细胞系（延边大学附属医院中心实验室提供）。SPF级BALB/c裸鼠（北京维通利华有限公司）共50只，生产许可证编号为SCXK （京）2016-0006，使用许可证编号为SYXK（京）2014-0023，均为雌性，周龄4～7周，均重20 g。在延边大学附属医院中心试验室SPF级别动物房饲养，环境温度18～22℃，湿度50%～60%。所有实验严格遵守伦理3R原则。

1.2 仪器与试剂

AIRTECH超净台（苏净安泰有限公司）;RDN-1000型细胞培养箱（中国杨辉生物仪器）;Frontier 5000 Multi Pro多功能离心机（中国OHAUS公司）;Acuson S2000微型超声仪（德国 SIEMENS 公司）。DANPs和PEG-DANPs （自制）;胎牛血清、胰蛋白酶、杜尔伯科极限必需培养基（DMEM）;磷酸缓冲液（北京朗润科技有限公司）;所用有机溶剂均为分析纯。

1.3 裸鼠NSCLC皮下移植瘤模型建立

实验前24 h Matricgel融化成液体;胰酶消化A549细胞，终止反应后摇匀制成细胞悬液，以1500 r/min离心，加入PBS液，调整细胞浓度至1×105个/mL，将Matricgel液加入细胞（1∶1） 制成造模用注射液。取20只BALB/c裸鼠，平均分成4组，在裸鼠左腋窝下注射0.1 mL（约3×106个细胞 ），待形成皮下移植瘤模型。每日观察荷瘤裸鼠全身状况、活动情况，以注射处出现瘤体作为造模成功标准，造模成功率为100%。每隔3～4天称量体重并用游标卡尺测量移植瘤体的长径（L）、短径（W）1次，取每例各小鼠肿瘤长短径平均值，按公式V=1/2（L×W2）计算移植瘤平均体积，并绘制肿瘤生长变化曲线及裸鼠体重变化曲线。

1.4 裸鼠NSCLC原位癌模型建立

取30只裸鼠腹腔内注射氯胺酮和甲苯噻嗪进行麻醉。使裸鼠处于右侧卧位，消毒左侧胸壁，在mid-axillary线（低肋线上1.5 cm处）切开5～10 mm，剥离脂肪和肌肉，通过胸膜，注入细胞悬液25～30 μL[1∶1， （1～3）×106细胞与基底膜基质混合]，non-silk线缝合切口，形成原位癌模型[4]（图1）。术后继续饲养，自由进食，每日观察荷瘤裸鼠全身状况、活动情况，以裸鼠mid-axillary线最菲薄处可扪及瘤块突起作为造模成功标准，造模成功率为76.7% （23/30）。取造模成功且一般状况较好的20只裸鼠平均分为4组进行治疗，剩余3只处死。

1.5 方法

将移植瘤模型裸鼠和原位癌模型裸鼠培养约13 d，直到皮下肿瘤的平均体积达到约120 mm3，分别以5%葡萄糖注射液（对照组），DANPs、PEG-DANPs及US+PEG-DANPs进行治疗。将裸鼠仰卧位固定于试验台上，不麻醉通过尾静脉进行药物注射，剂量为20 mg/kg，同时右手持超声仪探头，探头接触皮下组瘤块、原位组肺部进行超声照射，超声波辐照强度为1 MHz，单次辐照时间为30 s。每疗程为7 d，共4个疗程。当末次治疗结束后48 h，将全部皮下组和原位组裸鼠以颈椎脱臼法处死，取出瘤块、肺、肝等脏器并浸泡在10%的中性甲醛中固定，进行HE染色。

1.6 NSCLC模型裸鼠治疗后HE染色半定量分析

使用图像分析系统进行半定量分析。癌细胞排列情况、细胞核形态、染色深浅、异型程度、肺泡内有无癌栓形成、肝组织有无癌巢形成、有无纤维组织增生或出血、有无癌细胞变性坏死。无或正常为0分，逐渐递进，直至重度或明显异常为3分[5]。

1.7 TUNEL 法检测NSCLC模型裸鼠癌细胞凋亡

严格按照试剂盒说明书配制反应物，将Tunel反应混合物滴加至DANPs、PEG-DANPs和US+PEG-DANPs组，将dUTP滴加至5%葡萄糖组，在避光条件下进行POD 转化，光镜观察直至颜色发生变化，加入PBS 终止反应，苏木复染后冲洗、脱水、封片。

1.8 统计学分析

应用SPSS18.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC皮下移植瘤组裸鼠瘤块体积与各种治疗方法的关系

随着治疗时间的增加，DANPs、PEG-DANPs和US+PEG-DANPs组裸鼠皮下瘤块体积的增长均得到不同程度的抑制，而抑制肿瘤生长效果最佳的一组为US+PEG-DANPs组（*P=0.041<0.05;**P=0.001<0.01）。见图2。

2.2 NSCLC皮下移植瘤组裸鼠体重与各种治疗方法的关系

根据裸鼠体重与不同药物组曲线来看，DANPs、PEG-DANPs和US+PEG-DANPs組裸鼠的体重在不同程度上均出现下降趋势，即出现体重减轻的副作用，而US+PEG-DANPs组在维持裸鼠体重方面效果最佳（*P=0.039<0.05）。见图3。

2.3 NSCLC原位癌裸鼠肺组织和肝组织病理与各种治疗方法的关系

从原位癌模型的肺组织HE染色病理图可以发现（封三图3），5%葡萄糖组肺泡内存在巨大癌栓，细胞核异型性显著;DANPs组细胞核变浅，癌栓体积较5%葡萄糖组显著缩小;PEG-DANPs组肺泡内未见癌栓，可见局灶性癌细胞变性及坏死，细胞核明显变淡;US+PEG-DANPs组细胞核呈红色，无癌栓及核分裂相，可见纤维组织增生。提示US+PEG-DANPs抑制原位癌最为有效。A549肺癌原位癌模型的肝组织病理图（封三图4），5%葡萄糖组光镜下可见肝组织内巨大癌巢，细胞核深染，异型性显著;DANPs组癌细胞分裂依旧典型，细胞核深蓝色，但癌巢体积较5%葡萄糖组减小;PEG-DANPs组癌巢明显缩小，细胞核颜色明显变浅;US+PEG-DANPs组肝组织趋近正常染色，未见核分裂相。由此可知，US+PEG-DANPs疗法对肝转移的抑制作用较明显。

2.4 NSCLC原位癌裸鼠肺组织和肝组织病理图半定量分析

分别随机选取原位癌裸鼠肺、肝切片各15个，利用图像分析系统进行半定量评分。与其他给药组相比，US+PEG-DANPs组凋亡指数存在显著差异（P<0.05），提示其具有更好的抗瘤、抗转移疗效。见表1。

2.5 TUNEL 法检测皮下移植瘤裸鼠肿瘤细胞凋亡情况

见封三图5。5%葡萄糖组内极少发现凋亡细胞，细胞体积大、深蓝色，排列紧密;DANPs组：细胞较5%葡萄糖组缩小，颜色变淡;PEG-DANPs组：细胞较DANPs组进一步缩小，排列疏松，呈淡染的棕色;US+PEG-DANPs组：可见大量凋亡细胞，细胞排列疏松，呈显著的棕黄色，可见凋亡小体的存在。

3 讨论

本研究结果显示，US结合PEG-DANPs可以有效抑制NSCLC裸鼠瘤块的生长，同时具有较小的毒副作用，这是因为PEG-DANPs进入机体后，没有像大多数市售抗癌药一样被网状内皮系统所吞噬，而是主动与NSCLC肿瘤细胞相结合，具有较高的靶向性。另外，其拥有较长的半衰期和良好的缓释性，使其对肿瘤具有较好的治疗效果[6]。当PEG-DANPs通过胞吞（Clathrin-mediated endocytosis）方式进入癌细胞后[7]，其携带的主要成分多西他赛（Docetaxel，DTX）迅速与细胞内微管蛋白结合，破坏肿瘤细胞结构并抑制肿瘤细胞生长[8];另外，PEG-DANPs通过阻止癌细胞有丝分裂，导致癌细胞增殖减少[9]，发挥抗癌作用。

TUNEL染色技术被认为是检测细胞凋亡的金标准。具有高敏感、高特异性等特点，于早期即可快速地检测到细胞凋亡，是目前广泛接受与使用的监测细胞凋亡的实验方法。本研究结果显示，与其他治疗方法相比，US+PEG-DANPs镜下凋亡细胞数、凋亡面积最大（达70.35%），提示其引起A549细胞凋亡的能力最好。

本研究与前期研究的最大不同在于，创新性地增加US照射这一手段。本研究结果显示，US+PEG-DANPs对裸鼠NSCLC模型的治疗效果较为明显，分析其具体机制：首先，US照射肿瘤时，肿瘤血管内的液体在减压作用下形成的负压区产生大量真空微气泡，而当转换成增压作用时，这些真空微气泡受压破裂，瞬间形成超过上千个大气压的冲击力，使药物制剂穿过分子间隙，直接被推入癌细胞内发挥抗癌作用[10]，即空化作用;从化学角度来看，空化作用可产生巨大的压强，能提升细胞膜对钾、钙离子的通透性，抗癌制剂便能够更快地进入癌细胞[11]，即弥散作用。其次，当药物制剂进入癌细胞后，US的机械振动效应可引起癌细胞内的物质运动，这也称为超声的“按摩作用”，通过超声波的细微按摩，药物制剂在细胞浆内震荡、摩擦、循环，使细胞内部结构发生变化，坚硬的部分变松软，这样药物便能够充分地与细胞相接触并发挥抗癌作用[12]。最后，US产生的“热效应”也发挥着一定的作用，热作用首先在一定程度上可以杀死肿瘤细胞，目前在临床上应用的超声刀等技术就是依据这种原理[13]。本研究结果显示，照射产生的温度并未达到超声刀那样的程度，因此这种作用是可以忽略的，热作用在本研究中主要体现为促进肿瘤组织局部血液和淋巴循环加快，新陈代谢加速，使药物更容易渗透入细胞而提高药物吸收[14]。

另外，本研究使用的高频探头所产生的超声波类似于以探头为底而向组织深处延伸的圆柱体，其不会向肿瘤周边正常的组织扩散，因此几乎不会损害周边正常组织[15]。肺泡中的癌栓及肝组织中的癌巢这些病灶，位置较深，单纯药物难以到达，US照射可以促进肿瘤部位血液及淋巴液的循环[16]，由此提升肿瘤局部的新陈代谢，从而更好地将药物制剂引入深层结构中[17-19]。有学者利用US结合纳米抗癌制剂对乳腺癌及前列腺癌进行治疗，取得了较为满意的效果[20-21]，以上研究也进一步证明本研究的结果。

正常肺组织为含气器官，因气体对声波的全反射，一般来讲，超声束很难到达深部的肺组织。然而，有学者研究表明[22]，当肺脏病变有一部分与胸壁接触或病灶与胸壁距离较短时，是可以形成声窗以供超声波照射。在本研究中，首先种植在裸鼠mid-axillary线上的瘤块紧贴菲薄的胸壁，其次裸鼠肺部体积小，深部组织距探头的距离极近，故本研究超声波可以到达病灶。

综上所述，US结合PEG-DANPs的这种治疗方式，可以作为晚期NSCLC患者的一种新选择，具有一定的推广价值和前景。

[参考文献]

[1] Martin R，Klaus FR. Precision diagnosis and treatment for advanced non-small-cell lung cancer[J]. New Engl J Med，2017，377（9）：849-861.

[2] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2016[J]. Ca A Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[3] Manolescu D，Davidescu L，Traila D，et al. The reliability of lung ultrasound in assessment of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Clin Interv Aging，2018，22（13）：437-449.

[4] Quan XQ，Kang L，Yin XZ，et al. Synthesis of PEGylated hyaluronic acid for loading dichloro（1，2-Diaminocy-clohexane）platinum（II）（DACHPt） in nanoparticles for cancer treatment[J].Chinese Chem Lett，2015，22（26）：695-699.

[5] Silvia G，Maria IA，Emanuele D，et al. Morphological and semiquantitative kinetic analysis on dynamic contrast enhanced MRI in triple negative breast cancer patients[J].Acad Radiol， 2019，26（5）：620-625.

[6] 金光明，金明姬，尹學哲，等. 聚乙二醇化多西他赛白蛋白纳米粒用于非小细胞肺癌模型的实验研究[J].中国新药杂志，2017，26（23）：2871-2876.

[7] 叶鹏，陈莉，李丹，等. 多西他赛固体脂质纳米粒抗乳腺癌效果及机制研究[J]. 现代生物医学进展，2016，16（33）：415-420.

[8] Ran R，Liu YY，Gao HL，et al. PEGylated hyaluronic acid-modified liposomal delivery system with anti-γ-Glutamylcyclotransferase siRNA for drug-resistant MCF-7 breast cancer therapy[J]. Pharl Biotech，2015，104（5）：476-484.

[9] Huang Y，Deng S，Luo X，et al. Evaluation of intestinal absorption mechanism and pharmacokinetics of curcumin-loaded galactosylated albumin nanoparticles[J]. Inter J Nanomed，2019，14（9）：9721-9730.

[10] Mahnaz A，Nima FM. Within-day and between-day reliability of thickness measurements of abdominal muscles using ultrasound during abdominal hollowing and bracing maneuvers[J]. J Body Mov Thera，2017，22（1）：122-128.

[11] Lee JH，Moon HW，Han HK，et al. Antitumor effects of intra-arterial delivery of albumin-doxorubicin nanoparticle conjugated microbubbles combined with ultrasound-targeted microbubble activation on VX2 rabbit liver tumors[J]. Cancers，2019， 11（4）：581-596.

[12] Ding W，Wu CS. Effect of ultrasonic vibration exerted at the tool on friction stir welding process and joint quality[J].J Manuf Process，2019，42（5）：192-201.

[13] Zhao G，Wang Z，Hu S， et al. Effect of ultrasonic vibration of molten pool on microstructure and mechanical properties of Ti-6Al-4V joints prepared via CMT+P welding[J]. J Manuf Process，2020，52（8）：193-202.

[14] Wang H，Yuan Y，Chen Y. Characterization and mechanism of accelerated curing of adhesives by in situ ultrasonic vibration for bonded joints[J]. J Polym Eng，2019， 40（1）：1-12.

[15] Ramon A，Beatriz A，Consuelo B，et al. Simultaneous determination of multiclass emerging contaminants in aquatic plants by ultrasound-assisted matrix solid-phase dispersion and GC-MS[J]. Envir Sci Pollu Res Inter，2017， 24（9）：1-10.

[16] Zhang Y，Wan CF，Du J，et al. The in vitro study of Her-2 targeted gold nanoshell liquid fluorocarbon poly lactic-co-glycolic acid ultrasound microcapsule for ultrasound imaging and breast tumor photothermal therapy[J]. J Bio Sci Poly，2018，29（1）：57-62.

[17] Jin GM，Jin MJ，Yin XZ，et al. A comparative study on the effect of docetaxel-albumin nanoparticles and docetaxel-loaded PEG-albumin nanoparticles against non-small cell lung cancer[J]. Inter J Oncol，2015，47（5）：1945-1953.

[18] Jin GM，Jin MJ，Jin ZH，et al. Docetaxel-loaded PEG-albumin nanoparticles with improved antitumor. Efficiency against non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep，2016， 36（2）： 871-876.

[19] Zhang HJ，Chen JJ，Zhu X，et al. Ultrasound induced phase-transition and invisible nanobomb for imaging-guided tumor sonodynamic therapy[J]. J Mater Chem B，2018，6（6）：156-162.

[20] Ji D，Yan D. Factors of survival rate，relapse-related pathology and ultrasound imaging of patients with breast cancer confirmed by ultrasound screen[J]. Modern Med J China，2019， 21（9）：1-5.

[21] Song C，Sun WJ，Xiao YH，et al. Ultrasmall iron oxide nanoparticles：Synthesis， surface modification，assembly，and biomedical applications[J]. Drug Discov Today，2019， 38（10）：371-380.

[22] 李長隆. 肺部疾病的彩色多普勒超声诊断及分析[J]. 临床肺科杂志，2013，18（3）：75.

（收稿日期：2020-07-16）